重组H5亚型流感病毒HA1抗原的制备及其特性分析

为获得重组表达的H5亚型流感病毒血凝素(HA1)抗原.将PCR扩增的H5亚型流感病毒HA1基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pETHA1-H5.结果显示,转化pETHA1-H5的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下以包涵体形式表达了HA1蛋白.HA1重组蛋白能与不同禽类(鸡、鸭和鹅)H5亚型流感病毒阳性血清发生特异性反应,同时以HA1重组蛋白为抗原制备的单克隆抗体具有与H5亚型完整病毒粒子抗原反应的能力,说明重组表达的HA1蛋白保留了自然条件下H5亚型流感病毒的抗原特征.将重组表达的HA1蛋白作为ELISA抗原检测禽血清中的H5亚型流感病毒抗体,以HI试验结果为参考,两者的符合率为96.6%,证明HA1重组蛋白作为ELISA检测抗原是可行的.     

胶体金方法检测H3和H7亚型禽流感病毒

用微波法制备金溶胶,对禽流感病毒(AIV)H3和H7亚型单克隆抗体(H3-1D6和H7-1F7)用亲和层析法进行纯化,优化单抗与金溶胶的最佳结合条件后,喷涂于玻璃纤维上制成金标垫.将纯化的马抗H3和H7亚型AIV多克隆抗体和山羊抗鼠二抗分别包被于硝酸纤维素(NC)膜上作为检测线和质控线,制备胶体金检测试纸条.用制备的试纸条对H3和H7亚型AIV标准抗原、毕赤酵母真核表达蛋白和已知样品进行检测,结果与血凝试验、血凝抑制试验、AC-ELISA和RT-PCR方法相符.同时用该方法对H5和H9亚型AIV标准抗原、病料以及传染性支气管炎、新城疫等抗原进行检测,结果均为阴性.该方法操作简单,肉眼于10 min内可判定结果,且达到了血凝试验和血凝抑制试验的敏感性.     

检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用

本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法.实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27ug/mL(1:800),酶标抗体最佳稀释倍数为1:800,待检血清最佳稀释倍数为1:10.对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI).特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性.对临床样品检测表明C-ELISA与HI 方法的符合率达到93%以上.该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法.     

H5亚型高致病性禽流感病毒抗原捕捉ELISA诊断方法的建立

本研究在已有H5亚型禽流感病毒特异性单抗基础上,建立了以多抗作为包被抗体、单抗作为检测抗体的抗原捕捉ELISA方法。通过对各个反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为：羊血清1：1600倍稀释;单抗1：10000稀释;酶标抗体最适工作浓度为1：5000倍稀释;单抗反应时间1．5h;酶标抗体作用时间1．5h。特异性试验和敏感性试验结果表明：该方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感病毒的检测。     

欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件:抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1:200,封闭时间为1 h,一抗血清最佳作用时间为2 h,酶标二抗最佳稀释度为1:40 000,二抗最佳作用时间为1 h,TMB显色时间为7 min。阴/阳性血清的判断结果分别为OD_(450)≤0.255和OD_(450)≥0.292,介于两者之间为可疑。符合性试验结果显示,建立的间接ELISA方法与血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)检测的阳性率分别为53.27%和49.53%,两者总复合率达96.27%。特异性试验结果显示,该方法与古典H1N1亚型和H3N2亚型猪流感阳性血清无交叉反应。通过重复性试验表明,同一批制备的重组蛋白包被96孔酶标板,检测OD_(450)值的批内变异系数为1.97%~7.85%,批间变异系数为1.94%~6.93%。总之,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA方法,具有敏感性较高、特异性强、重复性好的特点,为猪流感抗体检测提供了一种准确、快捷、简便、有效的技术手段,可用于禽源H1N1亚型猪流感抗体检测和流行病学调查。     

H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立

本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10~(2.63) TCID_(50)/100μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰H_2O_2的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1∶3 200的HI=2~(-9)标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。     

应用禽呼肠孤病毒σ_3融合蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立

将表达的禽呼肠孤病毒(ARV)σ3融合蛋白纯化后作为抗原,建立了检测ARV抗体的间接ELISA方法,并对ELISA的反应条件进行了摸索,确定了抗原的最适包被浓度为3.98μg/mL,检测血清最适稀释倍数为1∶200,血清与抗原反应最佳反应时间为37℃作用2h,酶标二抗最佳作用时间为37℃作用1h,底物的最佳显色时间为25min。包被的抗原不与新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒等阳性血清发生交叉反应。用该方法建立的ELISA诊断方法,具有很好的敏感性和特异性,为ARV的诊断和检测以及血清学调查提供良好的技术手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA方法的建立

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳(N)蛋白作为包被抗原,建立了PRRSV抗体检测的间接ELISA方法,并优化确定了ELISA最佳工作条件:重组抗原包被浓度为13.3 μg/mL,37℃1h或4℃过夜;5％脱脂乳37℃封闭2h;血清1:40稀释,37℃作用90 min;酶标二抗1∶4000稀释,37...     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链式反应检测方法的建立

参考GenBank登录的H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,利用DNAStar软件分析其同源性,利用Primer Premier5.0软件设计3对分别针对AIVH5、H7和H9亚型的特异性引物。3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228、830bp。结果显示,利用3对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。该方法对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228、830bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对H5、H7和H9亚型AIVcDNA的最低检出量分别为10-4、10-2和10-4。结果表明,本试验建立了可同时检测鉴别H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。     

H5亚型禽流感病毒HA1基因在Sf9昆虫细胞中的表达及其抗原性检测

利用pBlueBacHis2杆状病毒载体在昆虫细胞Sf9中表达H5亚型禽流感病毒（AIV）的HA1基因。Western-blotting证明HA1在昆虫细胞中得到了表达，其产物具有抗原性；且不与H7、H9AIV的抗血清发生交叉反应，具有良好的特异性。Dot-ELISA结果显示，表达蛋白可以在非变性条件下与相应抗体作用，同样具有良好的抗原性。试验结果证明，表达的H5亚型AIV的HA1蛋白，为检测禽类体内是否感染H5亚型AIV和监测免疫禽类血清H5抗体水平提供了优良的检测抗原。     

禽流感H5、H7和H9亚型多重PCR方法的建立

为了建立能够同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的多重PCR检测方法,本文分别针对各病毒亚型的HA基因高度保守序列设计了3对特异性引物。通过对反应条件的优化,成功建立了在一个反应中同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的多重PCR诊断方法。根据其敏感性的结果可知,该方法对这3种亚型病毒的最低核酸检测量均为1×10~4拷贝/μL,且该方法特异性良好,具有灵敏、快速、成本低等优点,对禽流感病毒的流行病学调查具有指导意义。     

Serologic surveillance of swine H1 and H3 and avian H5 and H9 influenza A virus infections in swine population in Korea

Influenza A is a respiratory disease common in the swine industry. Three subtypes, H1N1, H1N2 and H3N2 influenza A viruses, are currently co-circulating in swine populations in Korea. An outbreak of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus occurred in domestic bird farms in Korea during the winter season of 2003. Pigs can serve as hosts for avian influenza viruses, enabling passage of the virus to other mammals and recombination of mammalian and avian influenza viruses, which are more readily transmissible to humans. This study reports the current seroprevalence of swine H1 and H3 influenza in swine populations in Korea by hemagglutination inhibition (HI) assay. We also investigated whether avian H5 and H9 influenza transmission occurred in pigs from Korea using both the HI and neutralization (NT) tests. 51.2% (380/742) of serum samples tested were positive against the swine H1 virus and 43.7% (324/742) were positive against the swine H3 virus by HI assay. The incidence of seropositivity against both the swine H1 virus and the swine H3 virus was 25.3% (188/742). On the other hand, none of the samples tested showed seropositivity against either the avian H5 virus or the avian H9 virus by the HI and NT tests. Therefore, we report the high current seroprevalence and co-infectivity of swine H1 and H3 influenza viruses in swine populations and the lack of seroepidemiological evidence of avian H5 and H9 influenza transmission to Korean pigs.     

Development of vaccine strains of H5 and H7 influenza viruses

To establish vaccine strains of H5 and H7 influenza viruses, A/duck/Hokkaido/Vac-1/04 (H5N1) [Vac-1/04 (H5N1)], A/duck/Hokkaido/Vac-3/07 (H5N1) [Vac-3/07 (H5N1)], and A/duck/Hokkaido/ Vac-2/04 (H7N7) [Vac-2/04 (H7N7)] were generated from non-pathogenic avian influenza viruses isolated from migratory ducks. Vac-1/04 (H5N1) and Vac-3/07 (H5N1) were generated by genetic reassortment between H5N2 or H5N3 virus as an HA gene provider and H7N1 or H6N1 viruses as an NA gene provider. Vac-2/04 (H7N7) was a genetic reassortant obtained using H7N7 and H9 N2 viruses to give high growth character of the H9N2 virus in chicken embryonated eggs. The results of sequence analyses and experimental infections revealed that these H5N1 and H7N7 reassortant viruses were non-pathogenic in chickens and embryos, and had good growth potential in embryonated eggs. These viruses should be useful to develop vaccines against H5 and H7 highly pathogenic avian influenza viruses.     

禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,参考GenBank中H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列的保守区域,利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物,预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强,对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性;敏感性高,H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝/μL。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子生物学诊断方法。     

H1、H3、H9亚型禽流感病毒多联RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的H1、H3、H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列,通过多序列对比,在保守区域内设计了3对特异性引物,对PCR反应体系的各组分进行试验调整,建立了一种H1、H3、H9亚型AIV多联RT-PCR检测方法,在2h内即可判断待检样品中是否有这3种亚型AIV的存在。经灵敏性及特异性试验以及临床样品检测结果证明,该方法灵敏度高、特异性好、结果准确,能够作为H1、H3、H9亚型AIV的快速检测方法。     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）检测效率，及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域，设计并合成了相关探针和引物，建立了禽流感病毒（AIV）四重荧光RT-PCR检测方法，该方法可在检测禽流感病毒（AIV）的同时，确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示，该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品，经检测，其中有60份样品为流感病毒阳性，且全部是H9亚型，该结果与行业标准方法（NY/T 772—2013）检测结果一致，κ值为1（P<0.001）。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测，将在AIV快速检测中发挥重要作用。     

Seroepidemiological evidence of avian H4, H5, and H9 influenza A virus transmission to pigs in southeastern China

Pig serum samples collected in southeastern China were examined for antibodies to influenza A viruses. Since the hemagglutination inhibition (HI) test does not accurately detect antibodies to the hemagglutinins (HAs) of "avian" influenza viruses, we utilized the neutralization (NT) test to detect subtype-specific antibodies to the HA of avian viruses in pig sera. Neutralizing antibodies to H1, H3, H4, and H5 influenza viruses were detected in the serum samples collected in 1977-1982 and 1998, suggesting that pigs in China have been sporadically infected with avian H4 and H5 viruses in addition to swine and human H1 and H3 viruses. Antibodies to H9 virus, on the other hand, were found only in the sera collected in 1998, not in those collected in 1977-1982, correlating with the recent spread in poultry and subsequent isolation of H9N2 viruses from pigs and humans in 1998. The present results indicate that avian influenza viruses have been transmitted to pig populations in southeastern China.     

猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立

对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重PCR特异性引物,建立了猪流感H1N1、H1N2和H3N2亚型病毒多重RT-PCR诊断方法。采用该方法对H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒标准参考株进行RT-PCR检测,结果均呈阳性,对扩增得到的片段进行序列测定和BLAST比较,表明为目的基因片段。其它几种常见猪病病毒和其它亚型猪流感病毒的RT-PCR扩增结果都呈阴性。对107EID50/0.1mL病毒进行稀释,提取RNA进行敏感性试验,RT-PCR最少可检测到102EID50的病毒量核酸。对40份阳性临床样品的检测结果是H1N1、H1N2和H3N2亚型分别为16份、1份和20份,其它3份样品同时含有H1N1和H3N2亚型猪流感病毒,和鸡胚分离病毒结果100%一致。试验证明建立的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法是一种特异敏感的诊断方法,可用于临床样品的早期快速诊断和分型。