猪乙型脑炎病毒E基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪乙型脑炎病毒SA14-14-2基因序列设计2对引物,从分离的猪源乙型脑炎病毒SD-001株的细胞培养物中扩增出包括E基因全长的两段基因.将扩增的目的片段进行克隆与序列分析.结果表明,所克隆的E基因编码结构域(Domain)区段与SA14-14-2、P3、Beijing-1等毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性分别达97.2%与96.8%以上,属于Ⅲ型乙型脑炎病毒,与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有8个氨基酸位点变异.     

乙型脑炎病毒分离株PrM/E基因测序和SA14、SA14-14-2的序列比较

该研究通过RT-PCR扩增乙型脑炎病毒分离株PrM/E基因测序后,将测序结果与GenBanK发表的JEV SA14基因序列和SA14-14-2进行比较分析,结果发现分离株与JEV SA14强毒株的同源性为98.1%,与SA1-14-2株的同源性为97.1%;在477-2477长为2 000 nt决定JEV抗源性的PrM/E区中.分离株与SA14株仅有40个碱基不同,其中12个碱基为错义突变,导致E基因2个氨基酸序列(E135和E232)与SA14的E区两个氨基酸的不同;而分离株与SA14-14-2株有48个碱基不同,导致E基因12个氨基酸序列与SA14-14-2不同.由于确定JEV毒性的10个关键性基酸的位置均在E蛋白上,分离株与SA14强毒株这10个氨基酸的位置完全一致,因此序列的比较结果表明;乙脑病毒分离株为强毒株.由此可以看出基因分析对于病毒毒力的判断具有重要参考意义.     

乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建

以乙型脑炎病毒SA14-14-2株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增prM／E基因的全长cDNA(约2kb)，将其克隆至pMDl8一T栽体，获得了克隆质粒pTprM／E，并对其进行了测序。序列分析结果表明，与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸比较，prM基因的序列同源性为100％，E发生了4个点突变，其中1个为回复突变，并导致了3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株为栽体，构建了1株乙脑病毒prM／E基因的重组伪狂犬病病毒TK／gG^-／ΓrM／E^ 。乙脑病毒prM／E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建，为开展乙脑病毒分子生物学及猪伪狂犬病-乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。     

表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建

本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

乙型脑炎病毒SAl4—14—2株prM基因的克隆与测序

以我国乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的基因组RNA为模板,设计1对包含prM基因完整编码区的引物,采用一步法RT-PCR技术扩增其prM基因,扩增出大小约558bp特异性带。将其克隆到pMD18-T载体中,用双脱氧末端终止法进行全序列测定,序列分析表明我国疫苗株SA14-14-2的prM基因核苷酸序列与GenBank收录的完全一致。prM基因的获得为进一步研究该基因的免疫原性以及乙型脑炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株prM基因的克隆与测序

以我国乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的基因组RNA为模板,设计1对包含prM基因完整编码区的引物,采用一步法RT-PCR技术扩增其prM基因,扩增出大小约558 bp特异性带.将其克隆到pMD18-T载体中,用双脱氧末端终止法进行全序列测定,序列分析表明我国疫苗株SA14-14-2的prM基因核苷酸序列与GenBank收录的完全一致.prM基因的获得为进一步研究该基因的免疫原性以及乙型脑炎病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

日本乙型脑炎病毒的分离与鉴定

收集一例疑为乙型脑炎病毒感染的种公猪肿大的睾丸病料,并将其处理制成匀浆过滤后,用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离病毒,然后设计一对PrM/E基因的特异性引物,采用RT-PCR方法对所分离的病毒进行鉴定,并将其PrM/E基因扩增产物测序,测序结果与乙型脑炎GenBank登陆的SA14-14-2株(AF315119)和SA14株(U14163)进行比较。结果表明,所分离病毒的PrM/E基因序列与JEV强毒株SA14和弱毒株SA14-14-2相应序列同源性分别为98.1%和97.1%,证实分离毒株为乙型脑炎病毒。     

猪乙型脑炎病毒的PrM-E基因克隆与测序

通过RT-PCR扩增乙型脑炎病毒主要抗原基因PrM-E,并将PrM-E基因克隆及测序后,与GenBank发表的SA14-14(M18370)基因序列进行比较分析,发现试验毒株与乙型脑炎病毒SA14-14毒株的同源性为98%。在乙型脑炎病毒基因组决定乙型脑炎病毒抗原性的PrM-E的2 000 bp序列中,试验毒株与SA14-14株有35个碱基不同,但却不影响它的功能。     

乙型脑炎病毒分离株PrM／E基因澳序和SA14、SA14—14—2的序列比较

该研究通过RT—PCR扩增乙型脑炎病毒分离株PrM／E基因测序后,将测序结果与GenBanK发表的JEVSA14基因序列和SA14—14—2进行比较分析,结果发现分离株与JEVSA14强毒株的同源性为98．1％,与SA1-14-2株的同源性为97．1％;在477-2477长为2000nt决定JEV抗源性的PrM／E区中,分离株与SA14株仅有40个碱基不同,其中12个碱基为错义突变,导致E基因2个氨基酸序列（E135和E232）与SA14的E区两个氨基酸的不同;而分离株与SA14—14-2株有48个碱基不同,导致E基因12个氨基酸序列与SA14—14—2不同。由于确定JEV毒性的10个关键性基酸的位置均在E蛋白上,分离株与SA14强毒株这10个氨基酸的位置完全一致,因此序列的比较结果表明;乙脑病毒分离株为强毒株。由此可以看出基因分析对于病毒毒力的判断具有重要参考意义。     

猪日本脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立

设计了1对引物,利用RT-PCR技术检测乙型脑炎病毒(JEV)。从GenBank中查出收录的31株猪乙型脑炎病毒E基因的已知序列,用DNA star软件对这31株猪乙型脑炎病毒E基因进行同源性分析,以确定扩增的靶序列。以这段靶区域为模板,利用Primer 5软件设计了1对引物,用减毒株SA14-14-2建立了检测乙脑病毒的RT-PCR方法,经敏感性,特异性试验测定,证明该方法敏感,特异;该法可检出样品稀释至256倍的鼠脑毒,相当于0.06个TCID50,对4株河北地区JEV分离株进行检测,结果所设计引物对4株病毒均能扩增出预期的片段。     

鸭源致病性大肠杆菌耐氟苯尼考floR基因的克隆与序列分析

为调查鸭源致病性大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的存在情况,利用PCR对20株临床分离的耐氟苯尼考的致病性大肠杆菌进行floR分子检测,分子检测结果显示,全部菌株floR基因阳性;对其中2株大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因floR进行了克隆和测序,结果表明,鸭源大肠杆菌floR基因片段的克隆测序结果与预期所得片段结果相符,长度为753 bp,2株鸭源大肠杆菌floR基因的同源性为99.6%,与牛源、鸡源等floR基因的同源性为84.8%～99.9%。系统发育分析发现,2株鸭源大肠杆菌floR基因不在同一支上,亲缘关系较远,表明floR基因的亲缘关系与该基因的来源动物无关。     

猪伪狂犬病毒H株gE基因的克隆及序列分析

参照已发表的扩增伪狂犬病毒gI和gE部分基因的PCR方法,合成了一对引物,以PRV H株细胞毒为模板,扩增出一条约850 bp的片段,并进行克隆和测序。然后与GenBank上国内外其它毒株gE基因进行核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分析,构建了遗传进化关系图。结果表明,PRV H株与其他15株PRV核苷酸和氨基酸的同源性分别为 97.0%～99.2%和93.2%～98.5%,其中与SH株最近,分别为99.2% 和98.5%;进化树分析表明,该毒株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外毒株分属不同分支,说明分离的H毒株与目前国内流行的毒株一致。     

牦牛病毒性腹泻病毒E 1基因的克隆及生物信息学分析

参考GenBank中发表的BVDV毒株的基因组序列设计2对引物,利用套式RT-PCR方法首次成功克隆牦牛体内分离鉴定出的牛病毒性腹泻病毒E 1基因,并扩增出预期的585 bp目的片段。将扩增产物克隆至pMD18-T Vector,经质粒PCR鉴定及酶切鉴定获得阳性重组质粒并进行测序。测序结果经BLAST同源性比较分析,克隆得到的E 1基因与Osloss株同源性最高,但核苷酸同源性仅为73.3%,推导氨基酸同源性仅为82.6%,表明牦牛病毒性腹泻病毒存在较大的基因突变。这可能是该病毒为适应牦牛这种特有生物体和牦牛所生活的高原生态环境的结果,或该病毒也可能具有独立的遗传衍化来源。     

两株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2 GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2,并对其测序.结果表明,所克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2基因核苷酸序列同源性在90.6%～99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在88.9%～98.7%之间.     

猬迭宫绦虫线粒体cox3基因的克隆及序列分析

本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅲ亚基（cox3）基因部分序列（pcox3）的遗传变异情况。利用聚合酶链反应（PCR）扩增猬迭宫绦虫的pcox3,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,同时利用DNAStar 5.0中的Megalign程序进行同源性分析,再用Phylip 3.67程序MP法绘制系统发育树,并与GenBank中已知猬迭宫绦虫相应基因序列进行比对分析。结果显示,所获得的pcox3序列长度一致,均为264 bp,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分支,来自湖南省的猬迭宫绦虫pcox3序列有微小差异。本研究结果为猬迭宫绦虫进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。     

植物乳杆菌α-半乳糖苷酶基因（melA）的克隆与序列分析

试验以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增α-半乳糖苷酶基因（melA）基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacⅠ和Sph Ⅰ酶切及PCR扩增鉴定,并对melA基因片段进行序列测定。结果表明,测得的melA基因序列全长2240 bp,含有酶切位点、启动子、SD序列及编码738个氨基酸的开放阅读框,理论分子质量为84 ku;4种核苷酸中GC含量为47.45%、AT含量为52.55%;序列中有3个碱基发生了变化,均为无义突变,未导致其推导的氨基酸的改变;序列测定结果与GenBank中登录的序列进行比较,核苷酸和氨基酸序列的同源性除与AY873840相比分别为96.6%和92.2%外,其余均大于99%。试验成功克隆了melA基因,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因的克隆及其序列分析

根据 GenBank 中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV- 2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出 ORF2 基因(702 bp)。将此基因片段克隆入 pMD -18 T载体,筛选获得重组质粒 pMD ORF2 并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性为99.5%与其它PCV- 2 的 ORF2 核苷酸序列同源性在92.1%~99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%~99.5%之间。     

菲莱氏温扬球虫18S rDNA基因的扩增与克隆分析

菲莱氏温扬球虫是鸭球虫病的重要病原之一,为了寻找种特异性的遗传标记,本研究采集广东省某鸭场的新鲜鸭粪,通过Sheather’s蔗糖漂浮法收集球虫卵囊,经形态学鉴定为菲莱氏温扬球虫;提取该球虫DNA样品,经过PCR扩增,首次获得了该虫的18S rDNA基因部分片段;对该基因进行了克隆和测序,比较了该虫株与其他原虫的亲缘关系。结果显示,对菲莱氏温扬球虫序列与艾美耳科其他球虫关系较近,系统进化树分析属于艾美耳科的另一分支。表明18S rDNA基因在鸭菲莱氏温扬球虫的分类鉴定上是一种有效的分子标记。     

小鼠隐藏管状线虫线粒体cox1基因的扩增及序列分析

对从试验小鼠体内分离的蛲虫样品PMZ1-5的线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基（cox1）的部分基因（pcox1）进行PCR扩增、测序及序列分析,并与网上相关序列进行比对分析,研究其线粒体pcox1基因遗传变异情况。结果表明,获得pcox1有效序列373 bp,经序列比对分析,发现5个蛲虫样品之间的变异很小,只有1个碱基的差异,序列相似性为99.73%～100%,BLAST分析结果表明为隐藏管状线虫,与同属的Syphacia montana序列差异性为5.24%～5.68%。结果表明,隐藏管状线虫的pcox1序列种内变异很小,种间差异明显,本结果为进一步研究蛲虫的群体遗传学奠定了基础。