应用TaqMan荧光定量PCR检测牛分枝杆菌

为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究以GenBank登录的M.bovis特有229 bp基因为研究对象,设计并合成引物及探针。该方法具有较好的特异性,与标准质控菌株呈阳性反应,与其他微生物样品呈阴性反应;灵敏性最低检测值可达1 pg/mL;对20阳性临床样品进行荧光定量PCR检测,均为阳性;而对培养为阴性的20份临床样品进行检测,6份为阳性。该研究结果表明,建立的方法特异性强,敏感性高,稳定性好,能够用于M.bovis的鉴别检测,对牛分枝杆菌病的快速检测和早期诊断具有重要意义。     

牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以牛支原体p80基因为靶基因,设计特异性引物与探针,优化反应体系,建立了牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR(TaqMan real-time PCR)检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性评估以及临床样本检测。结果显示,特异性试验中,牛支原体2个菌株Cq值均小于18,其余13个非牛支原体菌株Cq值均大于36;敏感性试验中,最低可检3.89拷贝/μL靶DNA,是普通PCR的10~4倍(普通PCR 3.89×10~4拷贝/μL);重复性试验中,组内、组间重复的变异系数均小于1%;44份牛的临床样品利用TaqMan real time PCR检出6份阳性(阳性率为13.64%),分离培养鉴定检出7份阳性,普通PCR检测全部阴性。本研究建立了一种敏感、特异、稳定的牛支原体TaqMan real time PCR检测方法,可用于牛支原体的快速诊断和核酸定量检测。     

Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

牛结核病两种活体诊断方法检测结合病原学诊断的研究

本文报道应用两种活体诊断方法检测牛结核病的试验结果。2010～2011年度,应用PPD皮内变态反应方法分3批次对5156头奶牛和奶水牛实施监测,监测阳性数57头,阳性率1.11%。采集该57头牛抗凝全血,应用γ-干扰素酶联免疫吸附试验进行检测,检出阳性样品3份,阳性率5.26%。对14头第一批PPD皮内变态反应阳性牛进行病理检验和进行细菌分离培养和PCR检测,结果3份样品分离培养呈阳性,其中1份PCR鉴定为结核分枝杆菌,2份为非分枝杆菌。PCR方法检测的14份组织样品中,2份为结核分枝杆菌阳性,1份为牛结核分枝杆菌阳性。结合病理剖检和病原PCR诊断,分析比较PPD皮内变态反应试验和γ-干扰素酶联免疫吸附试验的敏感性和特异性,由于PPD纯度、非特异性反应、结果判定的主观性等因素,导致PPD皮内变态反应监测检出假阳性率较高。     

荧光原位杂交在布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌检测中的应用

荧光原位杂交技术可快速鉴定病原菌,较传统病原分离鉴定方法具有明显优势。针对我国动物布鲁氏菌病和牛结核病这两个重要的人兽共患病,目前还没有标准的荧光原位杂交检测方法可供参考。为建立布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌荧光原位杂交检测方法,快速诊断动物布鲁氏菌病和牛结核病,利用布鲁氏菌探针Bru-996和结核分枝杆菌探针MTB770,通过优化杂交温度、杂交时间和样品处理等关键条件,确定最佳检测程序;根据已知背景的菌株和临床样品,对Bru-996和MTB770探针的特异性和敏感性进行评价,最终建立了荧光复位杂交诊断方法。结果显示:反应条件优化后,该方法可在4h内完成布鲁氏菌检测;荧光标记Bru-996探针与布鲁氏菌待检菌株的杂交结果均为阳性,而与结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌和大肠杆菌杂交结果均为阴性,并从5个已知背景的组织病料中成功检出布鲁氏菌。牛结核分枝杆菌检测则需要6~8h,杂交前必须对样品用二甲苯和溶菌酶进行处理;MTB770探针可特异性识别并能从牛肺部结节中检出牛结核分枝杆菌。结果表明,荧光原位杂交方法快速、简便,而且Bru-996和MTB770探针分别在布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌检测上具有较高的特异性,可替代传统的病原分离鉴定,作为动物布鲁氏菌病和牛结核病的实验室确诊方法。     

应用聚合酶链式反应(PCR)技术检测牛结核病

本试验应用聚合酶链式反应(PCR)技术原理,研究建立了牛结核病PCR检测方法。试验结果表明:该方法的敏感性测定模板浓度为30.4pg,特异性测定牛结核分枝杆菌在478bp出现特异扩增带。通过对298头份牛奶和229份牛全血样本进行检测,检出阳性牛奶样本33份,阳性全血样本43份;鲜牛奶样本同时还用罗氏培养后采取PCR方法进行检测,检出阳性样本34份;全血样本同时还用PPD进行皮内试验,检出阳性样本52份。试验表明:牛结核病PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、快速等优点,为牛结核病的早期诊断提供了科学依据。     

多重PCR-变性高效液相色谱法快速检测结核致病菌群并同步鉴别致病菌种

本研究旨在运用多重PCR联合变性高效液相色谱(DHPLC)技术原理,建立快速检测人兽结核致病菌群并鉴别主要致病菌种的新方法。建立了四重PCR-DHPLC方法,可同时检测结核分枝杆菌复合群(MTC)特异的IS6110和IS1081插入序列、结核分枝杆菌特异结构基因和牛分枝杆菌特异结构基因共4个目标基因。采用13种分枝杆菌标准菌株和分离株以及23种常见微生物样品进行特异性试验,采用纯化标准菌株DNA以及克隆了扩增序列的重组质粒DNA进行检测灵敏度试验,采用从临床疑似发病牛群采集的牛组织样品进行临床检测试验,并与细菌分离培养方法进行比对。结果表明:所建立的多重PCR-DHPLC方法能特异检测MTC并准确鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,而对其它11种分枝杆菌以及23种常见微生物样品均呈典型阴性检测结果;检测灵敏度达到每个反应102～103基因拷贝或3.6～6.8fg DNA模板浓度。采用该法从39份临床疑似样品中检出33份MTC阳性并检出其中28份为牛分枝杆菌阳性,而培养法检出21份阳性样品。采用该法临床检测全程可缩短至1d之内,其中对纯化DNA样品的检测分析可在2h内完成。本研究为人兽结核致病菌(群)的快速检测鉴别提供了新型分子生物学方法,所建立的四重PCR-DHPLC方法能实现快速检测结核分枝杆菌复合群并鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测牛鹦鹉嗜热衣原体

为了建立特异、敏感、快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,针对支原体ompA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立鹦鹉热嗜衣原体TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。并对来自宁夏地区三个规模化奶牛养殖场的376份流产奶牛样品利用鹦鹉热嗜衣原体IHA诊断试剂盒和TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR进行检测。结果表明:建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法敏感性为10 fg的总DNA,是一种可靠、快速、灵敏的检测鹦鹉热嗜衣原体的方法,并且成功应用于奶牛鹦鹉热嗜衣原体样本的检测。     

牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用

根据已发表的牛分枝杆菌的pncA的基因序列，设计和合成了一对可扩增294bp目的片段的引物，建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法。对牛分枝杆菌国际参考株和国内分离株成功扩增出294bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌和草分枝杆菌DNA的PCR扩增结果均为阴性。本PCR方法检测的敏感度可达到50pg。对10份牛分枝杆菌培养阳性和10份阴性样品的DNA分别进行了PCR检测，结果10份阳性样品中有9份样品为PCR扩增阳性，阳性符合率为90％（9／10）；而10份阴性样品则PCR扩增全部为阴性，阴性符合率为100％（10／10）。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速检测牛支原体(Mycoplasma bovis)的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank中收录的牛支原体OPPD/F基因序列(登录号:AF130119),利用Primer 5.0软件设计特异性引物与TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,构建检测牛支原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.994,扩增效率E=1.280。荧光定量PCR法检测的敏感性是常规PCR的10倍;特异性良好,检测9种相关细菌和病毒均为阴性;重复性好,组内及组间样本检测Ct值均小于2%。牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法较之于常规PCR方法有快速、特异性强、敏感性高、稳定性好的优点。     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

Observations of fracture of the anconeal process of the ulna of swine

Fractures of the anconeal process of 5 pigs ranging in age from 4 to 8 months were studied radiographically and histologically. Clinically, animals with a fracture of the anconeal process had a "tight," restricted gait. In pigs at 4.5 months of age, a radiolucent line through the base of the anconeal process was composed of fibrocartilage, fibrous connective tissue, and hyaline cartilage. Subperiosteal proliferation of woven bone was located along the cranial surface of the olecranon, adjacent to the base of the anconeal process. In older animals, the radiolucent line through the anconeal process contained variable amounts of fibrous connective tissue and fibrocartilage. The proliferation of subperiosteal bone at the base of the anconeal process formed a "buttress callus" which retained a radiolucent area between the callus and the proximal surface of the anconeal process. The latter region of radiolucency was continuous with the transversely oriented line that traversed the base of the anconeal process.     

Effects of size of ingestively masticated fragments of plant tissues on kinetics of digestion of NDF

Ingestively masticated fragments were collected and sized via sieving. Different sizes of esophageal masticate and ruminal digesta fragments, and ground fragments of larger masticated pieces were incubated in vitro, and undigested NDF remaining at intervals of up to 168 h of incubation was determined. The ruminal age-dependent time delay (tau) for onset of digestion of NDF was positively correlated (P < 0.004) with the mean sieve aperture estimated to retain 50% of the fragments between successive sieve apertures (MRA). Degradation rate of potentially degradable NDF (PDF) and level of indigestible NDF were not related (P > 0.10) to MRA of masticated and ground fragments. Estimates of tau were positively related to MRA, with slopes of bermudagrass < corn silage < ruminal fragments of corn silage. It was concluded that fragment size-, and consequently, ruminal age-dependent onset of PDF degradation of a mixture of different fragment sizes results in an age-dependent rate of degradation of the more rapidly degrading of two subentities of PDF. Models are proposed that assume a tau before onset of simultaneous degradation of PDF from two pools characterized as having gamma-modeled age-dependency and age-constant rates. The ruminal age-dependent pool seems to be associated with the faster-degrading pool, and its rate parameter increases with range in MRA in the population of fragments. Conceptually, the ruminal age-dependent rate parameter for PDF degradation seems to represent a composite of several effects: 1) effects of the size-dependent tau; 2) range in MRA of the population of ingestively masticated fragments; and 3) subentities of PDF that degrade via more rapid age-dependent rates compared with subentities of PDF that degrade via age-constant rates. The estimated fractional rates of ruminative comminution of ingestively masticated fragments (0.060 to 0.075/h) were of a magnitude similar to the mean fractional rates of PDF digestion (0.030 to 0.085/h), which implies that ruminative comminution may be first-limiting to fractional rate of PDF digestion. The in vivo roles of ingestive and ruminative mastication of fragments on PDF degradation must be considered in any kinetic system for estimating PDF digestion in the rumen. These results and others in the literature suggest that the rate of surface area exposure rather than intrinsic chemical attributes of PDF may be first-limiting to degradation rate of PDF in vivo.     

Mechanism of Action of Probiotic Function of Lactobacilli

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物.本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制.乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道.文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分(表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖)与肠道受体(C型凝集素受体、Toll样受体和Nod样受体),阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制.     

獭兔睾丸的组织学观察

家兔作为一种实验动物 ,推动了繁殖技术的发展。本试验通过对不同年龄公獭兔的睾丸进行组织学观察、测定 ,研究精子的发生规律 ,为系统地进行繁殖生理工作提供依据。1　材料与方法选 60日龄、75日龄、90日龄 3个年龄公獭兔各5只 ,用外科手术法摘取两侧睾丸 ,放入 Bouin氏液中固定 ,二甲苯透明 ,石蜡包埋 ,切成 5～ 8μm切片 ,H.E.染色。在显微镜下观察 ,并进行定量组织学指标测定及差异性比较。2　结果和讨论2 .1　睾丸定量组织学指标的测定结果　见表 1。表 1　獭兔睾丸定量组织学指标　　　μm,个 /精细管60日龄 75日龄 90日龄曲细精管…