MC1R蛋白在不同毛色太行山羊皮肤组织中的表达定位

MC1R基因是调节哺乳动物毛色形成的重要候选基因之一,编码黑色素皮质素受体1（MC1R）,在哺乳动物黑色素的代谢中发挥重要作用。分别选取纯黑色、纯白色、黄褐色和黑斑白色的太行山羊皮肤组织,通过HE染色技术,观察太行山羊的皮肤组织结构;利用免疫组化技术,对MC1R蛋白在4种毛色太行山羊皮肤组织中的表达情况进行研究。结果表明,太行山羊皮肤由表皮、真皮、皮下结缔组织3部分组成;MC1R蛋白在4种毛色太行山羊的表皮、真皮中均没有表达,但在纯黑、黄褐和黑斑白色太行山羊毛囊中有表达,且主要集中在毛囊外根鞘处。研究结果为太行山羊进一步的提纯选育工作提供了一定的依据。     

不同毛色绵羊皮肤组织中MC1R、Agouti及TYR基因差异表达研究

本研究旨在探究特定杂交模式下产生全黑被毛绵羊TYR、MC1R及Agouti基因互作调控毛色的机制。随机选取黑色和白色被毛绵羊各4只,采集皮肤组织,利用qRT-PCR技术测定MC1R、Agouti及TYR基因mRNA在不同毛色绵羊皮肤中的表达量。结果显示:MC1R、Agouti及TYR基因在不同毛色绵羊皮肤中均有表达,其中TYR基因mRNA在黑色绵羊皮肤中的表达量极显著高于白色绵羊皮肤(P<0.01),MC1R基因mRNA在黑色绵羊皮肤中的表达量高于白色绵羊皮肤,但差异不显著,Agouti基因mRNA在黑色绵羊皮肤中的表达量显著低于白色绵羊皮肤(P<0.05)。综上,该杂交模式下产生的黑色绵羊可能是由于Agouti基因表达量低而使α-MSH诱导信号通路处于激活状态,上调了TYR基因表达量,导致真黑素含量上升,出现黑色毛色性状。     

吐鲁番黑羊MC1R基因序列分析研究

为研究黑皮质素受体1（MC1R）基因对吐鲁番黑山羊毛色的影响,试验采用PCR扩增和测序技术,对吐鲁番黑羊MC1R基因编码区核苷酸序列及其与毛色的相关性进行了研究。结果表明：MC1R基因编码区核苷酸序列954 bp,编码317个氨基酸,编码区存在2个错义突变（c.218 T〉A,p.73 Met〉Lys;c.361 G〉A,p.121 Asp〉Asn）和3个同义突变（c.429 C〉T,p.143 Tyr〉Tyr;c.600 T〉G,p.200 Leu〉Leu;c.735 C〉T,p.245 Ile〉Ile）。SNPs分析表明,单倍型AATGT数量占62%。初步认为MC1R基因可以作为吐鲁番黑羊黑色被毛调控的候选基因。     

羊驼MC1R基因克隆及其在不同毛色个体中表达水平研究

为了获取羊驼MC1R基因序列,探索MC1R基因表达水平与羊驼毛色之间的相关性,根据GenBank已发表序列(EU1358800)设计1对引物,以羊驼皮肤总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增并成功获得了中华白色羊驼MC1R基因cDNA序列,长度为1 081 bp,编码317个氨基酸,与已发表序列进行对比,同源性为99%,发现7处突变.根据所克隆序列设计引物,采用实时荧光定量PCR技术(QRT-PCR),分析MC1R基因在白色和棕色羊驼皮肤中的基因表达量,并对结果进行统计分析.结果表明:经过内参基因校正后,棕色羊驼皮肤中MC1R基因的相对表达量是白色羊驼相对表达量的4.32倍(P<0.01).MC1R基因表达量的差异与羊驼毛色表型之间可能存在一定的相关性.     

绵羊MC4R基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

本研究旨在对绵羊MC4R基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考牛MC4R基因序列设计引物,采用PCR技术克隆绵羊MC4R基因序列,并利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析;同时对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆的绵羊MC4R基因全长1 919 bp,含有999 bp的完整CDS编码区,编码332个氨基酸。其CDS编码区的核苷酸序列与牛、人、猪、大鼠、小鼠MC4R基因对应序列的同源性分别为95.2%、68.8%、82.7%、76.6%、77.1%,预测的氨基酸序列同源性分别为97.0%、92.8%、93.7%、92.2%、91.6%。组织表达谱分析表明MC4R基因在各组织均不同程度的表达,其中在大脑表达量很高,其他组织较低。生物信息学预测MC4R蛋白功能发现,绵羊的MC4R蛋白存在7个跨膜螺旋结构域,同时预测MC4R存在10个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点。结果表明,MC4R是一个非常保守的蛋白,在绵羊的生长发育中起着重要作用。     

猪毛色基因MC1R的SNPs位点研究与应用

本研究旨在鉴定MC1R基因中与猪毛色紧密相关的SNP位点，明确不同SNP位点不同基因型与毛色的关系，并用于后代毛色的快速、高效预测和精准选育。通过采集不同猪种及杂交组合个体的耳组织样本共257个，提取耳组织DNA，采用Snapshot技术检测MC1R基因708bp、730bp、788bp位点SNP基因型。结果表明，在所研究群体中，可将MC1R基因708 bp、730 bp和788 bp位点作为黑毛色的分子标记，任一亲本在这3个位点基因型为AA、GG或CC时，子代(F₁代)毛色均为黑色。将鉴定的毛色相关SNPs应用于川乡黑猪世代选育，实现了川乡黑猪黑毛基因型的纯合。通过对MC1R基因的708 bp、730 bp和788 bp 3个位点中任意1个SNP进行检测，即分别选择AA、GG或CC基因型，可实现对黑毛色基因型的纯化，解决猪育种中后代毛色分离问题。     

太行鸡MC1R基因的克隆测序、表达及生物信息学分析

为研究影响太行鸡不同羽色性状的重要候选基因MC1R的表达及生物信息学特性,试验以太行鸡麻、白两种羽色为研究对象,采用PCR克隆、实时荧光定量PCR技术和生物信息学分析进行探讨。测序结果显示:太行鸡MC1R基因CDS序列为945 bp,编码蛋白为314个氨基酸;蛋白理化性质分析发现,MC1R蛋白存在7个跨膜区,为跨膜受体;CDS区序列比对发现,太行鸡MC1R基因存在c.637CT的突变,突变造成编码氨基酸mRNA二级结构和编码蛋白空间结构发生改变;实时荧光定量PCR检测发现,太行鸡麻羽品系毛囊中MC1R的表达量极显著高于白羽品系(P0.01)。研究结果表明:MC1R基因的c.637CT突变显著影响太行鸡的羽色,可以作为太行鸡羽色选育的候选分子标记。     

MC1R与Slc7a11基因多态性与哈萨克羊毛色相关的研究

本研究采集新疆伊犁哈萨克自治州特克斯县4种不同被毛颜色2~3周岁的220只哈萨克母羊血样用于提取DNA,其中黑色被毛羊52只,棕色被毛羊52只,青灰色被毛羊59只,白色被毛羊57只;并采集绵羊左侧肩胛皮肤样本,每种毛色各10个,用于组织形态学观察。本研究运用PCR-SSCP技术及测序技术对MC1R基因及Slc7a11基因多态性及其对哈萨克羊毛色的影响进行研究。运用皮肤样本制作切片用于不同毛色组织形态学观察。结果表明:MC1R基因突变位点在白色和棕色被毛群体中,只存在BB基因型;而在黑色和青灰色被毛群体中,存在AA、AB和BB 3种基因型;且AB基因型均为优势基因型,A等位基因为优势等位基因。由组织形态学观察可知,黑色和青灰色被毛组织毛囊分布极为相似,毛囊分布稀疏且皮脂腺发达;棕色被毛最具特色,毛囊丛分布明显,皮脂腺分布不发达;白色被毛毛囊分布最为密集,且皮脂腺分布密集并且最为发达。经χ~2检验,MC1R基因的基因型频率在4种毛色羊中的分布差异极显著(P0.01)。Slc7a11基因位点在伊犁哈萨克羊群体中发现其不存在多态性。     

蒙古白马KIT基因的多态性及组织表达研究

为研究kit基因与蒙古白马褪色毛形成的相关性,采用实时定量PCR技术对不同毛色蒙古马皮肤组织中kit基因的表达量进行了相对定量检测,并对该基因的5'调控区和全部编码区进行了多态性研究。结果显示:不同毛色蒙古马皮肤组织中kit基因的表达量存在极显著的差异(P<0.01),在骝色毛个体中该基因的表达量最高,而褪色毛个体中该基因的表达量相对较低,在该基因的全部编码区和部分5'调控区未发现任何多态。结果证明:kit基因与蒙古白马的褪色毛形成具有典型的相关性。     

黑素皮质素受体1(MC1R)在不同毛色羊驼皮肤组织中的表达与定位研究

旨在通过研究黑素皮质素受体1(MC1R)在羊驼皮肤组织中的定位与表达,探讨其在羊驼毛色形成中的作用机制及与毛色的相关性。选用成年白色羊驼与棕色羊驼为研究对象,采用免疫组织化学方法及免疫印迹法(Western blotting),对MC1R在羊驼皮肤中的表达进行定位和定量分析。结果,(1)免疫组化结果显示,MC1R蛋白在白色和棕色羊驼皮肤表皮、毛囊周围外根鞘组织、毛乳头以及毛球周围都呈阳性着色。在棕色羊驼,阳性表达部位主要分布于毛球顶部及表皮,呈强阳性着色。在白色羊驼,阳性表达部位主要在外根鞘及表皮,毛球部表达呈弱阳性。MC1R在棕色羊驼皮肤组织中极显著表达(P<0.01)。(2)Western blotting结果显示,羊驼皮肤组织粗蛋白提取物中存在分子量约35ku与兔抗MC1R多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,且棕色羊驼平均蛋白表达量显著高于白色羊驼,差异极显著(P<0.01)。MC1R在羊驼皮肤组织中的定位与表达量的不同与羊驼毛色表型之间存在一定的相关性。     

蒙古马突触融合蛋白17(STX17)基因多态性及在不同毛色皮肤组织中的表达分析

为研究突触融合蛋白17(STX17)基因与蒙古马毛色之间的相关性及其作用机制.本研究利用半巢式PCR技术及实时荧光定量PCR技术对蒙古马STX17基因第6内含子的多态性以及不同毛色蒙古马皮肤组织中STX17基因的相对表达量进行了检测.巢式PCR结果显示:STX17基因在青毛蒙古马第6内含子处存在4.6 kb的重复片段,在其它毛色中不存在该重复片段;荧光定量PCR结果显示:STX17基因在蒙古马青毛皮肤组织中表达量最高,在骝毛皮肤组织中的表达量最低.结果证明蒙古马STX17基因与其青毛表型具有典型的相关性.     

Wnt3a在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位

本研究旨在探索Wnt3a在羊驼皮肤中的表达与定位.以不同毛色的成年羊驼为研究对象,应用荧光定量PCR技术分析不同毛色羊驼皮肤Wnt3a基因的相对表达量,并运用Western blotting及免疫组织化学法对Wnt3a蛋白在不同毛色羊驼皮肤中进行表达和定位研究.结果:荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中Wnt3a mRNA相对表达量是白色羊驼的2.9702倍;Western blotting结果表明,羊驼皮肤组织组蛋白提取物中存在相对分子质量约39 ku的产物,棕色羊驼皮肤平均蛋白表达量显著高于白色羊驼;免疫组织化学结果显示Wnt3a在羊驼皮肤毛囊的根鞘和毛球部呈阳性表达,根据光密度值分析得出Wnt3a在棕色和白色羊驼毛囊中的表达差异显著(P＜0.05).通过以上研究显示Wnt3a可能与羊驼毛色形成具有相关性.     

山羊DQB1基因分析及其组织表达分析

为探究金堂黑山羊主要组织相容性复合体II类基因(MHC class II DQ-beta 1 chain gene,DQB1)的结构与功能,及其组织表达特征。本研究采用PCR扩增DQB1基因并对其进行生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术检测其在金堂黑山羊不同组织中的转录情况。结果显示:金堂黑山羊DQB1基因长度为786 bp,编码261个氨基酸。同源性分析显示金堂黑山羊DQB1基因与8个物种的相应基因同源性均达到85%以上,表明DQB1基因具有较高的保守性。荧光定量PCR结果显示,该基因在金堂黑山羊心脏组织中转录水平显著高于其在脾、肌肉、肠的转录水平(p0.01),表明DQB1基因在不同组织中的转录水平存在一定差异。本研究为进一步探究DQB1的免疫功能提供参考依据。     

水貂酪氨酸酶(TYR)基因克隆、SNPs筛查及其皮肤组织mRNA差异表达分析

旨在克隆和分析水貂酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）基因编码区,揭示该基因编码区SNPs及其皮肤组织mRNA差异表达规律与水貂毛色表型的关系。本研究采集7月龄雄性金州黑水貂、名威银蓝水貂和红眼白水貂共计301个样本的血液,利用聚合酶链式反应（PCR）方法对水貂TYR基因5个外显子进行分段克隆,并拼接获得其完整编码区序列（coding sequence,CDS）;采用PCR产物直接测序技术筛查3种毛色水貂外显子1、4和5中的SNPs;采集9只7月龄雄性水貂（黑、灰与白色被毛各3只）背中部皮肤组织,通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）技术检测TYR基因mRNA在3种毛色水貂皮肤组织中的表达水平。结果表明,克隆的水貂TYR基因序列长2 391 bp,由5个外显子组成,编码区长1 596 bp,编码的531个氨基酸中包括信号肽（18个氨基酸）和成熟肽（513个氨基酸）,该序列已上传GenBank（KJ716783）。SNPs筛查发现,3种毛色水貂TYR基因外显子4和5不存在突变位点,外显子1发现2处变异：c.441G>A和c.138T>A,c.441G>A为同义突变且仅存在于金州黑水貂群体。qRT-PCR分析显示,TYR基因mRNA在3种毛色水貂皮肤组织中均表达,且在金州黑水貂中的表达极显著高于银蓝水貂和红眼白水貂（P<0.01）,在银蓝水貂中的表达显著高于红眼白水貂（P<0.05）。研究结果提示,TYR基因c.138T>A位点及其皮肤组织mRNA差异表达水平与水貂毛色显著关联。     

水貂酪氨酸酶(TYR)基因克隆、SNPs筛查及其皮肤组织mRNA差异表达分析

旨在克隆和分析水貂酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因编码区,揭示该基因编码区SNPs及其皮肤组织mRNA差异表达规律与水貂毛色表型的关系。本研究采集7月龄雄性金州黑水貂、名威银蓝水貂和红眼白水貂共计301个样本的血液,利用聚合酶链式反应(PCR)方法对水貂TYR基因5个外显子进行分段克隆,并拼接获得其完整编码区序列(coding sequence,CDS);采用PCR产物直接测序技术筛查3种毛色水貂外显子1、4和5中的SNPs;采集9只7月龄雄性水貂(黑、灰与白色被毛各3只)背中部皮肤组织,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测TYR基因mRNA在3种毛色水貂皮肤组织中的表达水平。结果表明,克隆的水貂TYR基因序列长2 391 bp,由5个外显子组成,编码区长1 596 bp,编码的531个氨基酸中包括信号肽(18个氨基酸)和成熟肽(513个氨基酸),该序列已上传GenBank(KJ716783)。SNPs筛查发现,3种毛色水貂TYR基因外显子4和5不存在突变位点,外显子1发现2处变异:c.441GA和c.138TA,c.441GA为同义突变且仅存在于金州黑水貂群体。qRT-PCR分析显示,TYR基因mRNA在3种毛色水貂皮肤组织中均表达,且在金州黑水貂中的表达极显著高于银蓝水貂和红眼白水貂(P0.01),在银蓝水貂中的表达显著高于红眼白水貂(P0.05)。研究结果提示,TYR基因c.138TA位点及其皮肤组织mRNA差异表达水平与水貂毛色显著关联。     

不同毛色牦牛皮肤组织学观察及MC1R基因功能验证

旨在阐明不同毛色牦牛皮肤组织形态学特点及MC1R调控黑色素合成的可能分子机制。采集大通牦牛(黑褐色)和天祝白牦牛(白色)各6头的背部皮肤组织,用甲苯胺蓝染色法分别对不同毛色牦牛皮肤组织进行染色,观察黑色素和成熟黑色素细胞的含量差异及分布特征,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MC1R在不同毛色牦牛皮肤中的表达差异。B16小鼠黑色素瘤细胞中转染shRNA MC1R干扰载体后,应用qRT-PCR和Western blot检测转染效率,分析比较各组中与毛色相关基因(Agouti、MITF、TYR)的表达差异性,利用酶标仪检测不同时间点黑色素产量。结果表明,两种毛色牦牛的表皮和毛囊周围均分布着大量的黑色素细胞,但天祝白牦牛仅在表皮基底层和毛根处检测到少量黑色素,而大通牦牛表皮层和毛囊处产生大量黑色素。与大通牦牛相比,天祝白牦牛皮肤中MC1R表达量极显著降低(P0.01)。在成功抑制MC1R的B16细胞中,TYR表达量极显著降低(P0.01),MITF表达量显著降低(P0.05),而Agouti表达量未发生显著变化(P0.05);同时黑色素含量减少。综上表明,黑色素大量沉积与MC1R高表达是导致牦牛毛色差异的原因。将shRNA MC1R载体成功转染B16小鼠黑色素瘤细胞后,MC1R的抑制情况与下游调控基因TYR表达一致,进而降低黑色素含量,说明MC1R对黑色素的合成及毛色形成起重要的调控作用。     

突触融合蛋白4在不同毛色小鼠皮肤组织的差异表达

旨在探讨突触融合蛋白4(Syntaxin4,STX4)在皮肤组织细胞中的表达与定位,确定其是否与毛色形成存在相关性。选择白、灰、黑3种毛色皮肤组织样品(6只昆明小鼠白毛色背部皮肤、6只C57BL/6小鼠灰毛色腹部皮肤和黑毛色背部皮肤)和体外培养小鼠黑色素细胞样品,通过PCR扩增、Real-time PCR、免疫组化和Western blot技术对STX4的表达情况进行定性和定量分析。结果表明:在3种毛色皮肤样品和黑色素细胞样品中均扩增出897bp CDS区序列片段;Real-time PCR检测显示,STX4在白灰黑3种毛色皮肤样品中均有表达,黑色皮肤表达量最高,灰色皮肤表达量次之,分别是白色皮肤的3.44倍和1.92倍;免疫组化结果表明,在白色和黑色皮肤表达于整个毛囊,包括角化细胞;在体外培养黑色素细胞也显示阳性表达;Western blot结果显示,在白、灰、黑色皮肤和黑色素细胞样品中均有STX4阳性条带,表达量与荧光定量结果一致。综上表明,STX4在小鼠皮肤组织、毛囊角化细胞、黑色素细胞有效表达,且表达量在白灰黑皮肤中呈递增趋势,推测STX4与小鼠毛色形成呈正相关性。     

滩羊TCHH基因CDS区遗传结构及表达模式分析

试验旨在分析滩羊TCHH基因的遗传结构,并检测该基因在同一月龄不同组织及不同月龄皮肤组织中的表达模式。通过基因同源扩增获得滩羊TCHH基因编码区(CDS)全长,并利用生物信息学技术对序列的同源性、蛋白基本性质及重复序列特征进行分析,同时利用半定量RT-PCR、实时荧光定量PCR对该基因在皮肤组织中的表达模式进行分析。结果显示,TCHH基因CDS区全长4 425 bp,包含两段重复序列,共编码1 474个氨基酸,滩羊TCHH氨基酸序列在物种内同源性较高,与山羊同源性可达96.3%,物种间的同源性较差,与人和家鼠的同源性分别为48.4%和40.5%。TCHH蛋白分子式为C_(8006)H_(13187)N_(2787)O_(2661)S_6,分子质量大小为191.26 ku,理论等电点为5.76,为亲水蛋白,其蛋白不稳定指数为119.37,稳定性较差。TCHH蛋白的氨基酸序列共包含2个保守区,分别为S-100型钙结合域和蛋白激酶结构域,富含α-螺旋,高达89.89%,推测其二级结构为长条棒状分子结构。组织表达谱结果发现,TCHH基因在皮肤组织中特异性表达,其mRNA表达量随着滩羊月龄的增加逐渐降低,与滩羊毛发卷曲性状的生长趋势一致,TCHH基因特殊的结构和表达模式表明该基因在滩羊的毛发卷曲性状中发挥着重要作用。本研究可为滩羊毛发生长的生物学机制研究提供重要的参考依据。     

MC1R基因在略阳鸡不同组织中的表达研究

试验以16周龄略阳鸡群体内的白皮肤鸡和乌皮肤鸡为研究对象,揭示MC1R基因在这两个类群的皮肤及胸肌组织中的表达差异。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分别对白皮肤鸡与乌皮肤鸡的皮肤和胸肌组织中MC1R基因的表达量进行分析。结果表明,MC1R基因在两个类群鸡的皮肤和胸肌组织均能表达;MC1R基因两个类群皮肤组织表达差异不显著(P=0.4430.05);MC1R基因在两个类群胸肌组织中表达差异不显著(P=0.5120.05);MC1R基因在白皮肤鸡皮肤和胸肌组织中表达差异不显著(P=0.8450.05);MC1R基因在乌皮肤鸡皮肤和胸肌组织中表达差异显著(P=0.0340.05)。MC1R基因仅在乌皮肤略阳鸡的皮肤和胸肌组织中的表达量存在差异。揭示出MC1R基因虽是调控色素沉积的主效基因,但其表达会受其它基因的影响和调控。