鲤春病毒血症病毒核蛋白的原核表达及初步鉴定

为原核表达鲤春病毒血症病毒(SVCV)核(N)蛋白,本研究采用RT-PCR方法扩增SVCV N蛋白基因(SVCV-N),克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,并转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达.SDS-PAGE分析表明,SVCV-N基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物约47 ku,与预期相符.Western blot检测表明,该重组蛋白可以被SVCV阳性血清所识别.     

鲤春病毒血症病毒新型液相芯片检测技术的建立

为建立检测鲤春病毒血症病毒（SVCV）的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中SVCV的G基因进行序列分析,设计SVCV特异性引物和探针并标记生物素,偶联荧光编码微球后与SVCV病毒RT—PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。结果表明液相芯片检测体系能够正确的检测出SVCV。病毒核酸的最低检出量为10pg,检测特异性高,初步建立了检测SVCV的液相芯片技术,为进一步构建其他水生动物病原体全新快速高通量检测平台奠定基础。     

鲤春病毒血症病毒(SVCV)人工感染锦鲤攻毒试验

为了研究鲤科鱼类感染鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)后的病理变化,试验通过使用本中心实验室采集和保藏的鲤春病毒血症病毒株(JX14-012)对养殖的锦鲤(Cyprinus carpio koi)进行人工感染试验,然后对对照组和试验组锦鲤进行鲤春病毒血症病毒检测,结果显示,试验组呈阳性,即已感染鲤春病毒血症病毒,对照组呈阴性;对试验组进行生化指标检测发现肝胰脏、肾脏受到严重损害导致功能不全;组织病理切片观察结果发现,脑、鳃、肝胰脏、脾脏、肾脏、肌肉各组织均出现不同程度的变性坏死。表明JX14-012病毒株对锦鲤进行攻毒能够使试验组锦鲤致病,该毒株感染锦鲤后可在其体内复制、增殖,且对锦鲤有一定的致病力。其表现出来的症状对进一步掌握鲤春病毒血症病毒病,及时诊断其危害具有重大的现实意义。     

流式细胞仪在快速测定鲤春病毒血症病毒滴度中的应用

本研究建立了流式细胞仪快速检测鲤春病毒血症病毒（spring viraemia of carp virus,SVCV）滴度的方法。运用荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）技术检测SVCV A1株对草鱼性腺细胞系（GCO）的感染情况。用SVCV病毒单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠抗体为二抗,运用FACS来检测感染后不同时间点,以及不同病毒接种量的阳性细胞率。感染第3天时为最佳的病毒滴度测定时间点,测得SVCV的病毒滴度为8.31×105 FIU/mL,最低检测病毒滴度为（1000 FIU/mL）,与传统空斑试验（plaque assay,PA）相比,两种方法测得的结果基本一致。实验结果表明,FACS是一种简捷、高效、直接的检测SVCV滴度的方法,是一种新型的病毒滴度测定方法。     

鲤春病毒血症病毒核酸适配体的筛选及分析

核酸适配体(Aptamer)是一类单链短DNA或RNA片段,具有一定的空间结构,对特定靶分子具有亲和力。本研究采用指数富集配体系统进化技术(SELEX),首次筛选出针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)的核酸适配体A2和A15,经过荧光PCR、凝胶阻滞和病毒中和实验,证明了其对SVCV具有结合力和抑制作用,在该病的检测和防治方面具有良好的前景。     

鲤春病毒单克隆抗体的制备

鲤春病毒血症（Spring Viraemia of Carp，SVC）是鲤科鱼类的一种急性、高致死率的传染病，被国际动物卫生组织（OIE）列为必须申报的疫病之一。1971年欧洲人首先报道了鲤春病毒血症，有资料记载，该病曾给欧洲中部和东部的鲤鱼养殖业造成巨大的经济损失。2002年4月美国北卡罗来纳州某养殖场的135000尾锦鲤暴发传染病，发病率达10％，同年6月美国威斯康星州的野生鲤鱼也大量发病。随后确认两起疫病病原均为鲤春病毒（SVCV），经OIE设在英国的OIE参考实验室鉴定表明，该病毒株与1998年英国从中国进口的金鱼中分离到的SVC病毒株一致，并称之为“中国株”。此举直接把美国SVC病毒株的来源指向中国，对中国活鱼尤其是观赏鱼的出口构成了重大威胁。     

鲤春病毒血症病毒研究进展

正鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)属于弹状病毒科[1],其基因组由负义单链RNA组成,长度约为11 kb,并含有N,P,M,G,L五个基因。这5个基因分别编码核蛋白N、糖蛋白G、磷蛋白P、基质蛋白M和RNA聚合酶L。SVCV是几种经济上重要鲤科鱼类高致病性病原体,是世界动物卫生组织(OIE)必须申报的病原微生物,给水产养殖业造成了巨大的经济损失。该病毒引起鲤春病毒血症病(SVC)主要在     

数字RT-PCR检测鲤春病毒血症的方法建立与应用

[目的]通过实时定量RT-PCR和数字RT-PCR两种方法的比对试验,建立快速检测鲤春病毒血症的数字RT-PCR方法。[方法]利用同一对引物和探针,以梯度稀释的方法测定两种方法针对SVCV的灵敏性、特异性及重现性。[结果]两种方法均能够检测出104倍稀释的SVCV,而数字RT-PCR可以检测出单个微滴中的SVCV,其灵敏度性高于实时定量RT-PCR。同时,两种方法的特异性都很强,对其他病毒,如传染性胰腺坏死病毒（IPNV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、病毒性出血败血病毒（VHSV）均未有扩增反应。两种方法的重现性也较好。[结论]数字RT-PCR方法比实时定量RT-PCR具有更高的灵敏度,在鲤春病毒血症的早期快速诊断方面具有重要作用。     

鲤春病毒血症病毒的致病机理及防治研究进展

正鲤春病毒血症(Spring viremia of carp,SVC)是由SVC病毒(SVCV)引起的一种严重的传染性病毒病,可造成鲤科(Cyprinidae)鱼类大量死亡~([1])。SVCV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae),水泡病毒属(Vesiculovirus),是一种负义单链RNA病毒~([2])。SVCV的基因组、结构特征及其编码蛋白的研究较多,但其作用     

针对不同形式猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白的抗体中和活性比较

GP5蛋白被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导中和抗体的主要蛋白,为探讨GP5蛋白诱导免疫保护的能力,本研究用杆状病毒/昆虫表达系统分别表达了全长和截短的GP5蛋白,同时用大肠杆菌表达系统表达了截短的GP5蛋白。三种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,以PRRSV全病毒作为ELISA包被抗原检测抗血清时,原核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶200,真核表达的全长GP5蛋白抗血清效价为1∶800,真核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶1 600。将获得的三种抗血清分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)进行PRRSV同源(PRRSV VR2332)和异源(PRRSV HeN-3)毒株的血清学中和试验,并通过实时定量PCR方法检测各组中PRRSV mRNA的绝对拷贝数,以抗血清的病毒阻断率≥70%的最大血清稀释度作为该血清的中和效价。结果显示:1)三种重组蛋白的抗血清对两种PRRSV毒株的中和效价均1∶2,不具有中和活性,部分稀释滴度的血清还增强了病毒的感染;2)抗PRRSV全病毒对照阳性血清对同源毒株的中和效价为1∶8,具有中和活性;对异源毒株的中和效价1∶2,不具有中和活性,同时还产生了ADE增强作用。上述研究结果提示,GP5的主要中和表位可能更多是构象表位,PRRSV全病毒中主要诱导中和抗体产生的蛋白可能并不完全在GP5蛋白上;PRRSV全病毒阳性抗血清虽然能够提供一定的免疫保护,但这种免疫保护只发生在同源毒株之间,对异源毒株并没有效果,反而会介导ADE效应发生。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性分析

将非典型犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）基因克隆到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建含N基因的重组供体质粒pFastBac-N,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经筛选获得含N基因的重组Bacmid DNA（rBacmid-N）,脂质体法转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒vBacmid-N。用vBacmid-N感染昆虫细胞Sf9,免疫印迹（Western blot）分析,在62kDa处出现一条特异蛋白条带,与重组N蛋白的理论值相符合;间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescent assay,IFA）检测,vBacmid-N感染的昆虫细胞sf9出现特异绿色荧光。以纯化的重组N蛋白为抗原建立CDV抗体间接ELISA检测方法,犬CDV阳性血清A450大于0.40,而犬CDV阴性血清A450小于0.05,显示了良好的抗原特异性与稳定性。     

鲤鱼春季病毒出血症病毒G基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

采用RT-PCR方法扩增鲤鱼春季病毒出血症病毒（SVCV）的糖蛋白（G）基因,将PCR产物插入到杆状病毒转移载体pFastBac 1中,获得重组转移载体pFastBac 1-G,将其转化入含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含有G基因的重组穿梭质粒rBacmid-G。在脂质体转染试剂的介导下,将rBacmid-G转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。提取重组杆状病毒基因组,用M13引物PCR鉴定。对重组杆状病毒感染的sf9细胞,通过电镜观察、SDS-PAGE、Western blotting进行检测,结果表明,重组蛋白在sf9细胞中获得正确表达,相对分子质量约58 000,与鼠抗SVCV阳性血清具有良好的反应原性。本试验为研究鲤鱼春季病毒出血症病毒G蛋白的生物学活性和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

微小隐孢子虫抗原CTL细胞表位预测及多表位基因的原核表达

应用多个服务器对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8＋细胞毒性T细胞（CD8＋cytotoxic T lymphocyte,CD8＋CTL）表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a（＋）,获得重组质粒pET-28a（＋）-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55．3％,纯化的重组蛋白纯度达75．1％。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下某础．     

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。     

猪干扰素α-1基因的原核表达与多克隆抗体制备

[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。     

大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及生物学活性分析

从大肠杆菌K88（LT＋,ST＋）菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因（ltb）,得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a（＋）定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。     

Heterologous Expression of a Gene Encoding a 35 kDa Protein of Mycobacterium avium paratuberculosis in Escherichia coli

The full-length open reading frame coding for a potentially immunogenic 35 kDa protein of Mycobacterium avium paratuberculosis was generated using polymerase chain reaction technology. The gene was inserted in-frame into Escherichia coli expression plasmid pQE32. The resulting recombinant plasmid pPMP35 was transformed into E. coli M15. Analysis of the E. coli induced with isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside revealed that the protein accumulated into the cytoplasm as insoluble inclusion bodies. The level of expression of the recombinant 35 kDa protein (P35) was more than 30% of the total protein of E. coli cells. Expression of the recombinant protein was confirmed by immunoblotting. The P35 reacted with a rabbit antiserum raised against a sonicate of M. a. paratuberculosis. The protein was also recognized by serum from a goat with clinical paratuberculosis. Further, a polyclonal antiserum against P35 recognized a 35 kDa band in a membrane fraction of M. a. paratuberculosis. Also, the protein provoked a significant skin reaction in outbred guinea pigs sensitized with M. a. paratuberculosis, as well as in those sensitized with Mycobacterium avium. The results indicate that the 35 kDa protein of M. a. paratuberculosis is a membrane protein, having a role in the cellular immune response.     

猪源流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

对H3N2亚型猪流感病毒NS1基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。采用RT-PCR方法扩增H3N2亚型猪源流感病毒的NS1基因（693bp）,并将该片段克隆至pET-28（a）构建重组表达质粒pET-NS1。将重组质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度1mmol／L的IPTG在不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,并经Western-blot分析表达产物的抗原性。pET—NS1重组表达质粒表达的NS1蛋白相对分子质量约为26kD,1mmol／L的IPTG诱导4h时蛋白表达量达到高峰。Western-blot印迹分析证实表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。NS1基因的原核表达产物可用来鉴别流感感染猪群和灭活疫苗免疫猪群。     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化

参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPVVP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM—T载体,获得重组质粒pGM—T—VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a—VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E．coli Rosetta（DE3）中,获得了基因工程菌株E．coli Rosetta（CVP2）,并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E．coli Rosetta（CVP2）以包涵体形式表达出了CPV—YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。