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相似文献
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1.
本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板,采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA(558 bp),用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物,回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中,获得了转移载体pPgG-PrM,并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明:与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较,PrM基因的同源性为100%。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-/gG^-/LacZ^+突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-/gG^-/PrM^+,为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。  相似文献   

2.
乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建   总被引:1,自引:0,他引:1  
以乙型脑炎病毒SA14-14-2株基因组RNA为模板,采用RT—PCR一步法扩增prM/E基因的全长cDNA(约2kb),将其克隆至pMDl8一T栽体,获得了克隆质粒pTprM/E,并对其进行了测序。序列分析结果表明,与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸比较,prM基因的序列同源性为100%,E发生了4个点突变,其中1个为回复突变,并导致了3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-/gG^-/LacZ^ 突变株为栽体,构建了1株乙脑病毒prM/E基因的重组伪狂犬病病毒TK/gG^-/ΓrM/E^ 。乙脑病毒prM/E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建,为开展乙脑病毒分子生物学及猪伪狂犬病-乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。  相似文献   

3.
伪狂犬病病毒鄂A株 TK/LacZ突变株的构建   总被引:4,自引:1,他引:3  
本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针,通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5.9kb的KpnI片段中含有TK基因,回收该片段并克隆于pUC18的KpnI位点。然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段,并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHI位点,构建转移质粒pUEKPZ。将该质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK-15细胞,待完全病变后在X-gal存在下筛选蓝斑,蓝斑纯化3次后,经PCR扩增、Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK  相似文献   

4.
乙型脑炎重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/NS+1的安全性及免疫性   总被引:1,自引:0,他引:1  
用含有日本乙型脑炎病毒 (SA14 - 14 - 2株 )非结构蛋白 NS1基因的重组伪狂犬病病毒 TK- / g G- / NS 1 免疫BAL B/ c小鼠和断奶仔猪。结果表明 ,该重组病毒对 BAL B/ c小鼠和断奶仔猪是安全的 ,免疫的 BAL B/ c小鼠能抵抗伪狂犬病病毒 (PRV )强毒 (Ea株 )的致死性攻击 ,免疫的断奶仔猪能产生乙型脑炎病毒 (JEV)特异性抗体和 JEV特异性 CTL 活性。  相似文献   

5.
为了研制出能够同时预防猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)感染的二联活疫苗,本研究将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和PEDV中国变异株的纤突蛋白免疫决定簇区域(S1)基因分别克隆至含有PRV胸苷激酶(TK)基因上、下游同源臂的穿梭载体pTK中,构建重组PRV转移质粒pTK-EGFP和pTK-S1。将重组质粒pTK-EGFP与PRV疫苗毒株Bartha-K61基因组DNA共转染Vero细胞,经绿色荧光蚀斑纯化得到重组病毒rPRV-EGFP。随后将重组质粒pTK-S1与rPRV-EGFP基因组DNA共转染Vero细胞,通过反向筛选EGFP阴性蚀斑,蚀斑纯化得到表达PEDV S蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV-S1。本研究将为更有效防控猪伪狂犬病和猪流行性腹泻提供辅助工具。  相似文献   

6.
伪狂犬病病毒鄂A株TK—/LacZ+突变株的构建   总被引:3,自引:0,他引:3  
本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针,通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5.9kb的KpnI片段中含有TK基因,回收该片段并克隆于PUC18铁KpnI位点,然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段,并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHi位点,构建转移质粒pUEKPZ,该将质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK-15细胞,待完全病变后在X-gal存在下筛选蓝斑,蓝斑纯化3次后,经PCR扩增,Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK-/LacZ 突变株。  相似文献   

7.
8.
构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.  相似文献   

9.
将来自质粒pFSV40的300bpBamHI/PstI片段[其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点]插入到质粒pUSK相应的酶切位点中,获得重组质粒USKSV40。该重组质粒中gG基因5’端编码区缺失了428bp。将来自质粒pcDNA3.1( )的946bpBglⅡEcoRI片段(其中含CMV启动子及部分多克隆位点)插入到质粒pUSKSV40的BamHIEcoRI位点,构建了通用载体pPRVCMV-uni,其中含有CMV启动子,SV40poly(A)以及NheI,Pme1,BamHI,BstXI,EcoRI,StuI,XbaI等7个单一克隆位点,将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间,用所获得的转移载体与TK/gG-/LacZ^ PRV基因组共转染PK-15细胞,经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达,从而证实该通用载体的构建是可行的。本研究研制以伪狂犬病病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。  相似文献   

10.
为了构建伪狂犬病病毒(PRV)TK/gI/gE三基因缺失重组病毒,试验以PRV-JL14作为母本株,将其基因组与转移载体进行同源重组后,以增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为标记基因进行筛选,先后敲除gI、gE和TK基因大部分序列,获得重组病毒PRV-ΔgIgE/TK,并将重组病毒在BHK-21细胞中传代培养并绘制其一步生长曲线,同时以不同剂量对小鼠进行攻毒试验。结果表明:TK、gI和gE基因缺失后的重组病毒基因组稳定,在BHK-21细胞中传代培养20代未见突变;与母本株PRV-JL14相比,PRV-Δg IgE/TK在BHK-21细胞中的增殖能力没有降低,且对小鼠的致病力显著降低。说明试验构建的重组病毒PRV-ΔgIgE/TK可以作为猪伪狂犬病的候选疫苗株。  相似文献   

11.
为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础  相似文献   

12.
为深入研究NS1蛋白的生物学功能,了解NS1蛋白在哺乳动物细胞中的分布和亚细胞定位情况.采用RT-PCR扩增出禽流感病毒NS1基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,经酶切和测序鉴定后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-NS1经脂质体介导转染293T细胞和Hela细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察NS1在细胞...  相似文献   

13.
为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因工程疫苗,以伪狂犬病毒(PRV)gE基因缺失标志疫苗株TK^-/gE^-/LacZ^+为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22(BHV-1 VP22)融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒(rPRV)TK^-/gE^-/VP22E^+/VP22M^+。经PCR、Southern blot、Western blot证实rPRV构建正确,并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应,并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK^-/gE^-/E^+与TK^-/gE^-/E^+/M^+进行比较。结果显示TK^-/gE^-/VP22E^+/VP22M^+可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应,BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。  相似文献   

14.
为获得可溶性表达的乙型脑炎病毒(JEV)NS1蛋白,将编码JEV SA14-14-2株NS1蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-c5X中,构建重组融合表达质粒pc5X-NS1;用重组质粒转化宿主菌ER2523后,经IPTG诱导得到可溶性的融合蛋白MBP-NS1;优化诱导表达条件,于28℃、0.3 mmol/L IPTG诱导4 h;最后融合蛋白经直链淀粉树脂柱纯化。结果表明:重组融合蛋白MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。  相似文献   

15.
为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。  相似文献   

16.
通过对狂犬病病毒鹿源(DRV)野毒株总RNA的提取,用RT-PCR方法扩增磷蛋白(NS)基因并与T载体连接、克隆,将其转化到大肠杆菌JM109细胞中,测定NS蛋白基因的序列,与其它已经发表的国际标准株、疫苗株等进行比较,分析其氨基酸的同源性,构建系统进化树,为狂犬病病毒野毒株全基因序列的测定奠定基础。  相似文献   

17.
To examine the effects of the NS1 and NEP genes of avian influenza viruses (AIVs) on pathogenicity in mice, we generated recombinant PR8 viruses containing 3 different NS genes of AIVs. In contrast to the reverse genetics-generated PR8 (rPR8) strain and other recombinant viruses, the recombinant virus rPR8-NS(0028), which contained the NS gene of A/chicken/KBNP-0028/2000 (H9N2) (0028), was non-pathogenic to mice. The novel single mutations of 0028 NS1 to corresponding amino acid of PR8 NS1, G139D and S151T increased the pathogenicity of rPR8-NS(0028). The replacement of the PL motifs (EPEV or RSEV) of pathogenic recombinant viruses with that of 0028 (GSEV) did not reduce the pathogenicity of the viruses. However, a recombinant virus with an EPEV-grafted 0028 NS gene was more pathogenic than rPR8-NS(0028) but less than rPR8. The lower pathogenicity of rPR8-NS(0028) might be associated with the lower virus titer and IFN-β level in the lungs of infected mice, and be attributed to G139, S151 and GSEV-PL motif of NS1 gene of 0028. In conclusion we defined new amino acid residues of NS1 related to mice pathogenicity and the presence of pathogenic NS genes among low pathogenic AIVs may encourage continuous monitoring of their mammalian pathogenicity.  相似文献   

18.
对PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明,该基因缺失疫苗10^5.0TCID50和10^6.0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的,并可保护妊娠母猪抵抗10^7.1 TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后,gE鉴刖ELISA试验表明,PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以10^5.0 TCID50和10^6.0 TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物,结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象,说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。  相似文献   

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