新城疫病毒TL1株P基因的克隆及序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒P基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR技术对新城疫病毒内蒙古分离株TL1的P基因进行了扩增。将扩增产物提纯后克隆入pGEM-Teasy载体,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。测序拼接得出P基因的序列长度为1248bp,该基因的ORF总长为1188bp,编码395个氨基酸。与GenBank下载的12株参考毒株比较P基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株核苷酸的同源性为99.8%,氨基酸的同源性为99.2%;与鹅源新城疫ZJ1株核苷酸的同源性为96.1%,氨基酸的同源性为95.5%,说明TL1株和与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株的同源性极高,它们三者亲缘关系较近,同属于基因VII型新城疫病毒。而与传统疫苗株LaSota核苷酸的同源性为83.4%,氨基酸的同源性81.8%,说明该毒株相对于经典的NDV在P基因上已发生了较大的变异。     

牦牛病毒性腹泻病病毒E2基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已发表的多株牛病毒性腹泻病毒的E2基因序列比较分析设计了3对引物,应用RT-PCR方法首次扩增出牦牛病毒性腹泻病毒的E2基因区637 bp的片段序列,经pMD18-T载体连接后克隆、测序,并与已发表的NADL、Osloss、Oregon C24V等毒株E2基因序列进行系统发育进化树比对分析,结果表明,牦牛病毒性腹泻病毒的E2基因无插入或缺失,系统发育进化分析表明,与其他毒株核苷酸同源性较低,最高仅为68.8%,推导氨基酸序列为68.4%。较低的同源性表明牦牛病毒性腹泻病毒存在较大的基因突变或者可能还具有独立的衍化来源。     

牦牛病毒性腹泻病毒E1基因的克隆及生物信息学分析

参考GenBank中发表的BVDV毒株的基因组序列设计2对引物,利用套式RT-PCR方法首次成功克隆牦牛体内分离鉴定出的牛病毒性腹泻病毒E1基因,并扩增出预期的585 bp目的片段。将扩增产物克隆至pMD18-T Vector,经质粒PCR鉴定及酶切鉴定获得阳性重组质粒并进行测序。测序结果经BLAST同源性比较分析,克隆得到的E1基因与Osloss株同源性最高,但核苷酸同源性仅为73.3%,推导氨基酸同源性仅为82.6%,表明牦牛病毒性腹泻病毒存在较大的基因突变。这可能是该病毒为适应牦牛这种特有生物体和牦牛所生活的高原生态环境的结果,或该病毒也可能具有独立的遗传衍化来源。     

牦牛病毒性腹泻病毒E 1基因的克隆及生物信息学分析

参考GenBank中发表的BVDV毒株的基因组序列设计2对引物，利用套式RT-PCR方法首次成功克隆牦牛体内分离鉴定出的牛病毒性腹泻病毒E 1基因，并扩增出预期的585 bp目的片段。将扩增产物克隆至pMD18-T Vector，经质粒PCR鉴定及酶切鉴定获得阳性重组质粒并进行测序。测序结果经BLAST同源性比较分析，克隆得到的E 1基因与Osloss株同源性最高，但核苷酸同源性仅为73.3%，推导氨基酸同源性仅为82.6%，表明牦牛病毒性腹泻病毒存在较大的基因突变。这可能是该病毒为适应牦牛这种特有生物体和牦牛所生活的高原生态环境的结果，或该病毒也可能具有独立的遗传衍化来源。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株E0基因的克隆与抗原表位预测

根据GenBank上发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) Oregon C24V株E0基因的核苷酸序列设计1对特异性引物,应用PCR技术扩增BVDV HB-DCZ株E0基因.将PCR产物克隆到pMD18-T载体,克隆产物进行序列测定与分析.结果显示,HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带,约为687 bp.序列测定结果表明,HB-DCZ株E0基因由681个核苷酸组成,编码227个氨基酸.与已公开发表的BVDV其他毒株核苷酸和推导氨基酸序列同源性相似顺序依次为:CCSYD 99％和98.7％、QHZK10 98.4％和97.8％、VEDEVAC 98.2％和97.8％、Oregon C24V80.9％和89.9％、Yak 74.2％和81.1％.HB-DCZ与CCSYD、QHZK10以及VEDEVAC株的遗传距离较近,与国际标准毒株C24V、Yak株的遗传距离较远.运用Kyte-Doolittle方案预测氨基酸的亲水性,采用Karplus-Schulz方案预测蛋白质的柔性区域,按Jameson-Wolf方案预测抗原指数,利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性.对预测结果综合分析,推测最有可能的B细胞表位位于N-端6～17、23～29、47～53、59～68、70～81、97～109、114～122、127～134、137～143、165～172、186～198和213～220.     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株（QY株）的F基因和HN基因.然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662 bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸.经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%.     

鹅细小病毒QY分离株NS2基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列设计并合成了扩增广东清远分离株(QY株)NS2基因的一对引物,利用PCR技术扩增出来长约1.5kb的目的片断,将其克隆到PMD18-T载体上,筛选重组质粒并进行了序列测定及分析,测序结果表明,GPV分离株NS2基因由1356个核苷酸组成,编码451个氨基酸。经与B株、DN株、FS株进行同源性比较,核苷酸的同源性分别为99.1%、99%和99%;推导的氨基酸同源性分别为98.7%、98.7%和987%。     

禽呼肠病毒P10、P17非结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据GenBank上的禽呼肠病毒(ARV)S1基因序列,设计并合成了一对跨越P10和P17非结构蛋白基因的特异性引物,对13个ARV毒株进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果显示,13个ARV毒株的P10蛋白基因ORF全长均为297bp,编码98个氨基酸;P17蛋白基因ORF全长为441bp,编码146个氨基酸。这13个ARV毒株P10、P17蛋白基因核苷酸同源性分别在96.6%~100%和95.2%~99.3%之间,推导的氨基酸同源性分别在98.2%~100%和91.9%~99.0%之间。将这13个ARV毒株与GenBank上其他正呼肠病毒毒株,包括番鸭株(DRV)和飞狐上分离到的内尔森海湾病毒(NelsonBayvirus,NBV)及两个澳洲分离株(ARM-1和SOM-4)进行同源性比较和遗传进化树分析,结果表明,呼肠病毒有地域和种类的差别。     

11株新城疫病毒广西分离株P基因的克隆和序列分析

根据基因库的新城疫病毒(NDV)的磷蛋白(P)基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对11个NDV广西分离株的P基因进行RT-PCR扩增和序列测定,P基因阅读框的核苷酸序列全长均为1188bp,编码395个氨基酸。核苷酸及氨基酸全序列比较分析,结果表明:11个NDV广西分离株与10个参考株的核苷酸序列同源性为81.2%～97.8%,氨基酸同源性为78.8%～97.0%。     

牛副流感病毒3型N基因的克隆与系统进化分析

扩增大庆地区分离的牛副流感病毒3型的N基因,并进行同源性分析。设计特异性引物,通过聚合酶链反应扩增牛副流感3型N基因,将该基因分别连接到克隆载体的BamHⅠ、HindⅢ酶切位点中,测定插入片段的核苷酸序列,并利用分子生物学软件进行同源性分析。序列分析结果表明,扩增获得BPIV-3-N基因全长1 548bp,编码515个氨基酸,该N段基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GenBank中日本分离株910N基因序列同源性较高,核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为100%。     

Retrospective genome analysis of a live vaccine strain of bovine viral diarrhea virus

A live bovine viral diarrhea (BVDV) vaccine, marketed as a derivate of the Oregon C24V strain, was used between the end of the 1960s and the beginning of the 1990s in Central Europe. Since laboratory investigations of mucosal disease cases in vaccinated animals suggested recombinations between the vaccine and wild type variants of BVDV, and recombinational nucleotide sequences seemed distinct from BVDV Oregon C24V, the aim of the present retrospective study was to analyze the genomes of pre-registration (termed here BVDV-Xpre) and of marketed (BVDV-X) batches of the vaccine. The results of the complete genome analysis of BVDV-Xpre confirmed that the original virus strain used at the start of the vaccine production was Oregon C24V. Surprisingly, the analysis of the complete nucleotide sequence of the BVDV-X marketed vaccine revealed that this strain belongs to the BVDV 1b subgroup, with a 93.7% nucleotide sequence homology to BVDV reference strain Osloss. The homology to BVDV Oregon C24V was significantly lower (77.4%), and a thorough sequence scanning showed that the genome of BVDV-X had not derived from Oregon C24V. These data indicate the very likely scenario that a strain different to Oregon C24V was picked up during the in vitro or in vivo passages for vaccine development. Despite of the virus-switch, the BVDV-X vaccine continuously maintained its innocuity and efficacy, as proven by the regular quality testing data, and the presence of the foreign virus remained unnoticed over many years. The results of this work emphasize that the contamination of commercially available live vaccines with exogenous BVDV strains is a real risk factor, and a unequivocal analysis, including molecular methods, is needed to verify their authenticity.     

牦牛病毒性黏膜病病毒P125基因的克隆及序列分析

试验参考GenBank中发表的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)毒株基因组序列设计了5对引物,利用PCR扩增出预期的3475 bp目的片段;将扩增产物连接至pMD19-T载体,经质粒PCR鉴定及双酶切鉴定获得阳性重组质粒并进行核苷酸序列测定。经BLAST同源性分析表明,牦牛BVDV P125基因与BVDV-Ⅰ型的NADL毒株P125基因的同源性为63.4%。系统分析结果表明,牦牛P125基因与BVDV标准毒株P125基因在遗传进化与亲缘关系上均较远,这可能是因为环境诱变的结果或该毒株具有新的遗传衍化来源。     

Expression of the E2 envelope glycoprotein of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) elicits virus-type specific neutralising antibodies

A region of genome from the NADL strain of BVDV corresponding to the coding sequence for the E2 glycoprotein has been molecularly cloned using RT-PCR. The viral cDNA sequence was used to construct vaccinia virus recombinants that expressed either the entire E2 coding sequence or fragments of it. These recombinants were used to immunise mice of three H-2 haplotypes to investigate their ability to elicit a neutralising antibody response against BVDV. Sera from mice immunised with the recombinant expressing full length E2 contained high levels of virus neutralising antibodies that in addition to giving neutralisation of the homologous NADL strain were also able to neutralise the Oregon C24V reference strain. These sera failed to give any neutralisation of the Osloss reference strain providing evidence for the division of BVDV isolates into at least two distinct E2 serotypes. These results were confirmed in gnotobiotic lambs. Expression of E2 fragments revealed the presence of at least two distinct neutralising epitopes, one of which was localised within the carboxy terminal 90 amino acids of the protein.     

绵羊肺炎支原体Y98 P30基因的克隆、表达及免疫试验

根据猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）跨膜蛋白P30基因序列设计引物,通过PCR克隆出绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,MO）膜蛋白P30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOP30基因与Mhp P30基因核苷酸序列同源性为79%。抗原表位及跨膜结构预测的结果表明,MO P30基因与Mhp P30基因的抗原表位及跨膜结构均具有高度的一致性。该片段中含1个TGA编码Trp,而不是终止密码子。将P30基因与原核表达载体pET-28a连接构建pET-28a-P30表达质粒,转化受体菌Rossta得到重组菌株Rossta（pET-28a-P30）。经诱导后SDS-PAGE表明有30 000左右的目的条带出现;Western blot表明Rossta（pET-28a-P30）表达的30 000蛋白主要以包涵体的形式存在;小鼠免疫试验表明Rossta（pET-28a-P30）原核表达的蛋白对小鼠具有一定的保护作用。     

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。     

长角血蜱甘肃株肌钙蛋白基因P27/30的克隆和序列分析

参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株肌钙蛋白P27/30基因的核苷酸序列,设计合成一对引物,从本实验室保藏的干净长角血蜱卵中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出607 bp的肌钙蛋白基因,将其克隆于PGEM-T-Easy载体,对其进行序列分析,并推导出氨基酸序列,将这一序列与国内外已发表的长角血蜱肌钙蛋白基因进行比较分析。结果表明本实验室保藏的长角血蜱甘肃株与上述已发表的Okayama株核苷酸序列同源性为92.1%,氨基酸同源性为86%。长角血蜱甘肃株与Okayama株、四川孤雌生殖株的发育有一定差异。经RT-PCR分析表明,该基因在长角血蜱的卵、幼蜱、若蜱和饥饿成蜱这几个阶段均有表达。     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株UL49基因的克隆和序列分析

根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %.     

新城疫病毒F_(48)E_9株P基因的克隆及鉴定

根据NDVP蛋白己知基因序列设计合成了一对引物PU/PL ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株P基因 12 72bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子从 5’端进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株P基因片段 5’端的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 83 7%。至此 ,我们获得了F4 8E9株P基因的全长克隆