两种检测试剂盒对猪瘟抗体水平检测结果的比较

选择一种由中国兽医药品监察所研制的国产试剂盒与美国IDEXX公司的进口试剂盒对300份猪血清同时进行检测,结果显示,两种试剂盒的符合率为83.67%;国产试剂盒检出的阳性率高于进口试剂盒;对检测结果不一致的49份血清用荧光抗体病毒中和试验(FVNT)进行了复核,国产试剂盒与FVNT的符合率为63.2%,进口试剂盒与FVNT的符合率为31.6%。试验结果表明,国产试剂盒具有更高的敏感性,能满足我国猪瘟抗体监测的需要。     

猪瘟病毒5种ELISA抗体检测试剂盒的比较

[目的]比较猪瘟病毒（CSFV）5种ELISA抗体检测试剂盒的使用效果。[方法]利用细胞中和试验制备的标准质控血清,制备不同猪瘟抗体效价的阳性血清70份和阴性血清20份,对5种试剂盒的敏感性、特异性和符合率进行比较。利用该5种试剂盒对不同年龄段猪群血清中猪瘟抗体水平进行检测。[结果] 5种试剂盒的敏感性为85.7%-100%,特异性均达到100%,符合率为88.9%-100%。不同年龄段猪血清样品中,5种试剂盒检测结果不尽相同。[结论]猪瘟抗体效价的高低对5种试剂盒检测结果的一致性有一定影响,尤其是针对弱阳性样品时,IDEXX猪瘟抗体试剂盒和荷兰赛迪公司的猪瘟抗体试剂盒检测效果相对较好,为猪瘟免疫检测工作提供了一定依据。     

4种商品化试剂盒检测猪瘟病毒抗体的比较分析

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒感染引起的猪的急性、热性、高度致死性传染病,是严重影响养猪业发展的主要疫病之一.世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类16种传染病之一,我国亦将其列为一类传染病,是发生最多、危害最大、流行最广的动物传染病之一.由于长期贯彻预防为主的指导思想,坚持广泛接种猪瘟兔化弱毒疫苗的防治措施,该病在我国已经得到有效控制,大规模的暴发流行基本停止[1].2009年,一些猪场发生典型的猪瘟,给猪场造成了极大的经济损失[2],致使许多兽医工作者和养猪业主对我国猪瘟疫苗的免疫效果产生了怀疑,从而给我国猪瘟的防制工作带来新的问题.     

非洲猪瘟病毒p54间接ELISA抗体检测方法的建立及试剂盒研制

非洲猪瘟是对全球养猪业危害最严重的病毒性传染病,目前尚无有效疫苗。p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要结构蛋白之一,参与病毒的吸附和侵入,是非洲猪瘟血清学诊断的重要靶标之一。本研究采用无标签的重组p54蛋白作为包被抗原,建立了ASFV p54间接ELISA抗体检测方法,优化了检测条件,组装成了试剂盒。根据对374份阴性猪血清的检测,确定了本试剂盒检测的临界值,并利用不同猪病原阳性质控血清进行了敏感性、特异性和稳定性研究。结果显示,本方法检测阴/阳性血清的临界值为0.250;敏感性血清质控品的最小检出限为1∶1 600倍,与ASFV阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸病毒综合征病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪细小病毒阳性血清和猪抗大肠杆菌阳性血清等6种特异性质控血清均无交叉反应;试制的3批试剂盒批间和批内变异系数均小于10%。试剂盒在2～8℃贮存9个月,特异性、敏感性保持不变。以上试验结果表明,本试剂盒具有良好的敏感性、特异性和稳定性,与OIE推荐的p72阻断ELISA抗体检测试剂盒具有较高符合率,为非洲猪瘟临床血清学诊断和抗体监测提供了良好的技术支持。     

犬狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

用狂犬病毒单克隆抗体预包被酶标板,将纯化的狂犬病毒作为检测用抗原,利用捕获包被法建立了间接ELISA法用于犬狂犬病病毒抗体的检测。通过优化ELISA条件,研制试剂盒并应用于犬狂犬疫苗的免疫效果检验。利用研制的试剂盒与RFFIT、商品化同类试剂盒对30份犬血清进行平行检测,总符合率分别为90%和93.33%,与其它几种常见犬病毒抗体阳性血清无交叉反应。试剂盒批内、批间变异系数分别为1.45%～5.79%和2.35%～7.21%,2～8℃保存12个月稳定。基于用单抗预包被后再包被检测抗原,本试剂盒检测样品抗体的灵敏度和稳定性得以显著提高,因此适合于不同来源狂犬疫苗人工免疫犬血清的RV抗体水平监测。     

应用进口ELISA试剂盒检测鸡传染性支气管炎抗体

鸡传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒引起鸡的一种急性高度接触性的呼吸道传染病，是严重危害我国乃至世界养鸡业的重要疾病之一。已有多种血清学方法可用于IB抗体检测，我国目前常用的方法有琼脂扩散试验（AGP）、血清中和试验（SN）、间接血凝试验（IHA）等。国内很多学者先后建立了ELISA方法检测IB抗体均取得理想结果，但仅限于实验室检测，在基层推广应用还有一定困难。作者在加04年7月至2004年11月应用美国Affinitech-IB抗体检测试剂盒对山东几个规模化养鸡场送检的血清样品进行了检测，现报告如下。     

新城疫间接ELISA抗体检测试剂盒的研究

利用新城疫Clone30株病毒研制了检测新城疫抗体的ELISA试剂盒。抗原最佳包被浓度为1．086μg／ml，被检血清最佳稀释度为1：100，酶标结合物最佳工作浓度1：800，血清样品阴阳性临界值为0．34。本试剂盒和HIPRA的ND试剂盒检测64份血清相比较，结果表明本试剂盒的特异性和敏感性分别为90％和93．2％。试剂盒保存期试验结果表明，试剂盒可保存3个月。     

间接ELISA在猪瘟抗体检测上的应用

间接ELISA以其灵敏、特异、简单、快速、稳定、高通量及易于操作等优点,在猪瘟免疫猪群抗体水平监测、猪瘟的快速诊断与流行病学调查中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就间接ELISA方法及其在猪瘟诊断上的应用概况做一综述,以期为我国猪瘟的综合防控提供参考。     

鸭瘟病毒抗体间接ELISA检测试剂盒的研制

将鸭瘟病毒（DPV）CHv株经过鸭胚成纤维细胞增殖、反复冻融、差速离心和蔗糖密度介质离心制备纯化抗原,建立了用于检测鸭血清中抗DPV特异性IgG抗体的间接ELISA方法,并对其进行了标准化研究,确定了最佳工作条件,研制了相应的检测试剂盒并对盒内各组分的保存条件、质量控制以及试剂盒的特异性、重复性进行了研究。结果显示,4.75μg/孔的纯化DPV抗原包被反应板可获得良好的特异性和敏感性,1∶100稀释的待检血清样品反应后D405 nm值换算为抗体效价的标准直线方程为y=1.573＋3.552x（r=0.953,n=40）。试剂盒在4℃保存3个月或-20℃保存10个月后各项性能都很好。应用该试剂盒对皮下注射、口服和滴鼻免疫DPV弱毒的20日龄樱桃谷鸭血液中抗DPV特异性IgG抗体效价进行了测定,皮下免疫鸭于第6 d,口服和滴鼻免疫鸭于第9 d可在血清中检测到DPV特异性抗体,且至第60 d时依然可检测到高效价抗体。证实,该试剂盒可用于鸭瘟的血清流行病学调查和鸭场免疫抗体水平的监测。     

6种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较

为了比较市场上国产及进口非洲猪瘟病毒(ASFV)ELISA抗体检测试剂盒的产品质量和使用效果,本试验对B、C、D三种进口试剂盒和A、E、F三种国产试剂盒进行敏感性、特异性和重复性比较。结果显示,试剂盒B、D、E、F分析敏感性均为1∶512;试剂盒C分析敏感性为1∶256;试剂盒A分析敏感性为1∶128;诊断敏感性比较结果为试剂盒B>试剂盒D、F>试剂盒E>试剂盒C>试剂盒A;6种试剂盒对7份特异性质控血清的检测结果均为阴性,表明6种试剂盒均具有排除潜在交叉反应的病原抗体的能力;诊断特异性比较结果为试剂盒A、C、D>试剂盒F>试剂盒E>试剂盒B;批内重复性结果显示,6种试剂盒的批内变异系数(CV%)均在15%以内。结果表明,非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测国产试剂盒与进口试剂盒的敏感性、特异性和批内重复性相差无几,国产试剂盒的兴起解决了以往过度依赖昂贵的进口试剂盒的问题,国产化替代进程在不断加速。     

猪瘟抗体间接ELISA检测方法的建立和优化

采用真核系统表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被物,通过对各个反应条件的摸索和优化,建立了检测猪瘟病毒抗体的猪瘟抗体间接ELISA检测方法。研究结果表明,E2蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/mL,最佳包被条件为4℃16h;待检血清的最佳稀释倍数为100倍;特异性检测试验证明,该方法与猪常见病原的阳性血清没有交叉反应。通过对大量猪瘟抗体阴、阳性血清的检测,最终确定了本检测方法的判定标准。     

非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立

以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。     

Establishment and application of a solid-phase blocking ELISA method for detection of antibodies against classical swine fever virus

BackgroundClassical swine fever (CSF) is a severe infectious disease of pigs that causes significant economic losses to the swine industry.ObjectivesThis study developed a solid-phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay (spbELISA) method for the specific detection of antibodies against the CSF virus (CSFV) in porcine serum samples.MethodsA spbELISA method was developed based on the recombinant E2 expressed in Escherichia coli. The specificity of this established spbELISA method was evaluated using reference serum samples positive for antibodies against other common infectious diseases. The stability and sensitivity were evaluated using an accelerated thermostability test.ResultsThe spbELISA successfully detected the antibody levels in swine vaccinated with the C-strain of CSFV. In addition, the detection ability of spbELISA for CSFV antibodies was compared with that of other commercial ELISA kits and validated using an indirect immunofluorescence assay. The results suggested that the spbELISA provides an alternative, stable, and rapid serological detection method suitable for the large-scale screening of CSFV serum antibodies.ConclusionsThe spbELISA has practical applications in assessing the vaccination status of large pig herds.     

检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

以猪伪狂犬病病毒（PrV）Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体，纯化的抗PrV IgG为检测抗体，建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为，单克隆抗体576株的包被浓度为12．2μg／mL，IgG的工作浓度为16．0μg／mL，对PrV的检测灵敏度达15．6ng（0．156μg／mL），与乙型脑炎病毒（JEV）、猪瘟病毒（HCV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪流感病毒（SIV）等无交叉反应。批间和批内变异系数较小，分别为6．39％和4．1％。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测，肺和脑PrV抗原检出率最高，其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测，发现二者的符合率可达到77．4％，比PCR敏感。实验结果表明：双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于动物组织中PrV的检测。     

单克隆抗体间接免疫荧光检测猪瘟病毒方法的建立

以作者制备的抗猪瘟病毒单克隆抗体(anti-CSFV McAb)为一抗、荧光素标记羊抗小鼠IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立检测猪瘟病毒抗原的间接免疫荧光(IFA)检测方法。确定IFA最佳工作条件:CSFV最佳接种浓度和培养条件为CSFV 10-3倍稀释后接种PK15细胞,37℃5%CO2恒温箱中培养36 h;McAb最适工作浓度为1∶1 000倍稀释;荧光素标记的羊抗小鼠IgG荧光抗体的最适工作浓度为1∶50倍稀释。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法检测CSFV感染PK15细胞为阳性,而检测伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)感染PK15细胞均为阴性。结果表明,建立的检测细胞培养中CSFV抗原的IFA检测方法具有敏感特异、简便快速等优点,可用于CSFV感染的实验室诊断及CSFV在感染细胞中的定位和动态分布研究。     

猪瘟病毒Core蛋白的原核表达和抗体制备及应用

根据猪瘟病毒衣壳蛋白(Core)基因序列设计一对特异性引物,RT-PCR从猪瘟兔化弱毒中扩增出完整的Core基因,经酶切和序列测定后,克隆到携带His标签的原核表达载体p ColdⅠ中,成功构建了重组质粒p Cold-Core,并转化到大肠杆菌Rosseta 2(R2)中;利用IPTG诱导表达目的蛋白并鉴定表达效果。结果表明:经终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导24 h后,Core基因在R2中获得分泌性可溶表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量为20 ku。Western blot结果显示Core蛋白可以分别与His单抗和猪瘟病毒阳性抗血清发生特异性反应,均出现单一反应带。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备特异性抗血清,Western blot结果显示该抗血清与衣壳蛋白反应后有明显的特异性条带,经激光共聚焦鉴定抗血清能够与胞浆中的猪瘟病毒粒子发生反应。结果表明,Core基因表达成功,制备的抗血清具有生物学功能。本研究为深入探讨Core蛋白在猪瘟病毒致病机制上的作用奠定了基础。     

可溶性E2蛋白作为抗原的检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立

以可溶性重组E2蛋白作为抗原,建立了猪瘟病毒(CSFV)血清抗体间接ELISA诊断方法(rE2-ELISA).将猪瘟疫苗毒株E2基因主要抗原区(A-D)基因克隆到表达栽体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至20℃,获得48 000大小E2融合蛋白,部分目的蛋白以可溶性形式表达.Western blotting试验证实,E2融合蛋白可以和CSFV阳性血清发生特异性结合.亲和层析纯化后的E2融合蛋白作为抗原,建立了检测CSFV血清抗体的间接rE2-ELISA方法.该方法的特异性试验结果表明,与PRRSV、PCV2、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rE2-ELISA和国外同类试剂盒(CSF-Ab-Kit)检测142份田问血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为83.81%和88.73%.因此,rE2-ELISA猪瘟抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合应用在大规模的CSFV血清抗体的检测工作中.     

猪瘟单克隆抗体的制备及ACI-ELISA检测猪瘟病毒的研究

本研究用猪瘟石门毒(CSFV-Shimen)免疫BALB/C小鼠,按常规单克隆抗体(McAb)技术方法制作,最终获得4株McAb,分别命名为AC9、CF8、DG5和EC9,4株McAb与基因工程CSFV E2蛋白反应结果表明:AC9、CF8和EC9是抗CS-FV E2蛋白的McAb.用AC9和CF8McAb对CSFV进行抗原捕获间接ELJSA试验(ACI-ELISA),通过一元McAb和二元McAb CAI-ELISA试验的比较,结果表明AC9与CF8两种McAb有协同作用,其捕获CSFV的能力比一元McAb显著提高.方阵试验结果表明:McAb和血清多抗(PcAb)的最佳工作稀释度分别为1:400和1:200.特异性试验和敏感性试验结果显示本法特异性强,敏感性高.最后用ACI-ELISA与PCR对30份病料的检测结果比较,表明ACI-ELISA与PCR检测结果相符.上述结果说明本研究所获得AC9和CF8可用作猪瘟诊断试剂盒的研制,是检测CSFV的有效方法.     

检测牛轮状病毒抗体间接ELISA方法的建立

利用CsCI密度梯度离心化的牛轮状病毒作为包被抗原,建立了检测牛轮状病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验(EuSA).用牛病毒性腹泻病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌制备的对照包被抗原与牛轮状病毒阴性和阳性血清反应,其结果均无交叉反应,说明该方法具有良好的特异性,可用于牛轮状病毒抗体的检测.     

用间接ELISA检测鸡痘病毒抗体的建立与应用

近年来鸡痘发病率和死亡率有增高趋势，并且免疫失败的病例时有发生。为了探明接种疫苗和感染鸡痘病毒后抗体产生规律，我们建立了用间接ELISA检测鸡痘病毒抗体，并经正交试验，确定了抗原、抗体的最佳反应条件，还用该法对2组人工感染、1组自然感染、1组疫苗接种和1组空白对照组鸡群的鸡痘病毒抗体进行了跟踪研究。