Fur/RyhB调控禽致病性大肠杆菌运动性机制的研究

大肠杆菌的运动性主要由鞭毛提供动力，鞭毛是致病性大肠杆菌重要毒力因子之一，本文通过探究Fur及其负调控的非编码RNA——RyhB对禽致病性大肠杆菌（APEC）运动性的影响，为探索防控禽大肠杆菌病的潜在靶点提供科学依据。通过Red同源重组方法构建AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB，比较缺失株与原始株运动性特征，结合转录组学数据探究Fur和RyhB对APEC鞭毛以及生物被膜形成的影响。结果显示成功构建了AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB，转录组学结果显示Fur的缺失基本上使所有鞭毛相关的基因下调。Fur的缺失使APEC的运动性显著减弱，RyhB对APEC的运动性没有显著影响，△Fur/RyhB较△Fur运动能力有所增加。△Fur和△Fur/RyhB生物被膜形成能力显著增强，△RyhB生物被膜形成减弱，与运动性趋势基本一致。Fur对禽致病性大肠杆菌的鞭毛组装有非常重要的作用，其负调控的RyhB一定程度上可以抑制这种作用机制的影响，并进一步影响了生物被膜的形成，为寻找相关药物靶点提供可能。     

非编码小RNA(RyhB)调控禽致病性大肠杆菌毒力相关基因的分析

以小RNA(RyhB)为研究对象,探索RyhB对禽致病性大肠杆菌相关毒力基因的调控研究。采用Red同源重组技术构建APEC野生株(AE17)RyhB的缺失株△RyhB以及构建出回复株△RyhB-comp。运用活菌计数法分别观察AE17、△RyhB、△RyhB-comp黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力,并且利用Real-time PCR检测AE17、△RyhB和△RyhB-comp的8个毒力基因转录水平。结果成功构建出了基因缺失株△RyhB和回复株△RyhBcomp,△RyhB黏附细胞能力较AE17均有显著地降低,约为AE17的62.5%,△RyhB-comp较△RyhB黏附能力显著上升,为△RyhB的1.4倍。同时,Real-time PCR结果显示,△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的转录水平均极显著下降(P0.01),其mRNA转录水平分别约为AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%;△RyhB的iss、ibeA毒力基因表达水平分别上调约1.14倍和1.2倍。表明RyhB的缺失能够减弱APEC黏附DF-1的能力,并且使毒力基因的转录水平有所降低。根据以上结果,推测RyhB对APEC的毒力具有极其重要的调节作用。     

ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌生物学特性及致病性的影响

大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2（Escherichia coli type III secretion system 2，ETT2）参与禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）的致病作用。本研究旨在探究ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌的生物学特性及致病作用的影响，为进一步阐明ETT2的致病机制提供依据。基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建epaPQR基因缺失株和回复株，通过生长曲线测定、运动性和生物被膜形成能力等试验，分析epaPQR基因对APEC生物学特性的影响；通过血清杀菌与组织载菌量等试验分析epaPQR基因对APEC致病性的影响。结果表明，成功构建ETT2结构基因epaPQR基因缺失株和回复株，epaPQR基因缺失后，其生长能力和生物被膜形成能力并没有显著改变（P>0.05）；但epaPQR基因缺失后，其运动能力显著降低（P<0.05），在透射电镜下观察到缺失株鞭毛数量明显减少，通过荧光定量PCR发现，鞭毛T3SS结构基因及鞭毛输出蛋白基因的转录水平均显著下调（P<0.05）。epaPQR基因缺失后其抗血清杀菌能力显著增强（P<0.05），缺失株AE81ΔepaPQR在雏鸡体内不同器官的定殖能力显著降低。结果说明，ETT2结构基因epaPQR参与调控APEC的鞭毛形成，影响APEC抗血清杀菌能力以及在体内组织器官的定殖能力，表明epaPQR在APEC致病过程中发挥重要作用，本研究为深入探究ETT2功能和APEC致病机制提供参考。     

Ⅲ型分泌系统2转录因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜调控机制的研究

生物被膜是导致细菌产生耐药性的主要原因之一,本文通过探究Ⅲ型分泌系统2（ETT2）转录调节因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成的影响及其影响机制,为探究ETT2对禽致病性大肠杆菌致病机制的影响提供研究基础。利用Red同源重组的方法构建yqeI基因缺失株,并通过检测野生株与缺失株生物被膜形成能力、结合转录组学测序及荧光定量检测生物被膜基因表达量等,探究转录调节因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成能力的影响。结果显示成功构建了yqeI基因缺失株,且yqeI的缺失并不影响生长曲线,但生物被膜形成能力显著下降,且相关生物被膜基因转录量显著下调。禽致病性大肠杆菌ETT2转录调节因子YqeI显著影响了禽致病性大肠杆菌生物被膜形成能力,为从ETT2及yqeI的角度发掘潜在的调控网络提供依据。     

Ⅲ型分泌系统2转录因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜调控机制的研究

生物被膜是导致细菌产生耐药性的主要原因之一,本文通过探究Ⅲ型分泌系统2(ETT2)转录调节因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成的影响及其影响机制,为探究ETT2对禽致病性大肠杆菌致病机制的影响提供研究基础。利用Red同源重组的方法构建yqeI基因缺失株,并通过检测野生株与缺失株生物被膜形成能力、结合转录组学测序及荧光定量检测生物被膜基因表达量等,探究转录调节因子YqeI对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成能力的影响。结果显示成功构建了yqeI基因缺失株,且yqeI的缺失并不影响生长曲线,但生物被膜形成能力显著下降,且相关生物被膜基因转录量显著下调。禽致病性大肠杆菌ETT2转录调节因子YqeI显著影响了禽致病性大肠杆菌生物被膜形成能力,为从ETT2及yqeI的角度发掘潜在的调控网络提供依据。     

禽致病性大肠杆菌唾液酸酶siaK1基因缺失株的构建及其生物学特性分析

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是危害养禽业发展的重要病原之一。本试验利用Red同源重组技术构建APEC IMT5155唾液酸酶基因sia K1缺失株和互补株,系统比较其生物学特性的差异。生长曲线测定表明,缺失株比野生株和互补株生长速度加快,而野生株和互补株的生长速度无明显差异;生物被膜形成能力测定表明,sia K1缺失导致细菌生物被膜形成能力显著减弱,而互补株可恢复至野生株水平,说明sia K1基因缺失可影响禽致病性大肠杆菌的生长速度及生物被膜的形成。本研究为进一步探讨sia K1基因功能奠定了基础。     

phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌的毒力调控作用

phoP/Q作为一种外在环境感受器,参与调节细菌对外部环境的适应性。本研究拟探讨phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)的生长、定植、毒力等生物学特性的影响。利用Red重组系统构建APEC AE 17株的phoP/Q双组分调控系统缺失株,并构建phoP/Q双组分调控系统回复质粒,转化缺失株,构建回复株。通过生长运动性试验、黏附入侵CEF细胞试验、毒力基因转录水平检测以及半数致死量(LD50)等试验比较野生株、缺失株、回复株的生物特性。与野生株相比,phoP-phoQ缺失不改变其生长特性;运动性较野生株下降63%;黏附与入侵CEF细胞能力分别降低69.83%(P0.01)和62.17%(P0.05);LD50显示毒力减弱13.3倍;polA、tsh基因转录水平分别上调41%、54%;sodA、iss分别下调64%和98%。phoP/Q双组分系统参与对APEC致病性的调控,该系统的缺失会降低APEC的致病性。     

禽致病性大肠杆菌phoP/phoQ基因敲除株的构建及其毒力基因转录调控的研究

为研究Pho P/Q二元调控系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病性的调控作用,本研究采用Red同源重组技术分别构建了APEC AE17株的pho P基因敲除株AE18和pho Q基因敲除株AE19,并通过p STV-28质粒分别构建pho P和pho Q基因回补株CAE18和CAE19。并对这些菌株的运动能力、对鸡胚成纤维细胞(CEF)的黏附和侵入能力以及其13个毒力基因的转录水平进行了检测。结果表明,pho P和pho Q基因敲除株运动性能力分别为AE17的70.92%和83.83%;黏附和侵入CEF细胞的能力比AE17均极显著降低,分别为AE17的63.11%、65.42%和59.83%、57.82%。荧光定量PCR结果显示,AE18的毒力基因(sod A、pol A和iss)和AE19的毒力基因(fim C和iss)比AE17相应的毒力基因m RNA的转录水平均呈极显著下降(p0.01)。此外,回补株CAE18和CAE19株能够部分恢复运动性能力、黏附和侵入CEF细胞的能力及相关毒力基因的转录水平。结果表明pho P和pho Q基因的敲除均能够显著改变APEC AE17株相关的生物学特性,并且能够调控毒力基因的转录水平,使其毒力显著下降。本研究为进一步了解APEC的Pho P/Q二元调控系统对其致病性影响提供实验依据。     

禽致病性大肠杆菌Ⅵ型分泌系统2evfC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了分析VI型分泌系统2(Type VI secretion system2,T6SS2)核心组分Evf C对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物学特性及致病性的影响,本研究采用Red同源重组系统构建APEC evf C基因缺失株,并利用低拷贝质粒p STV28构建互补株。然后比较分析野生株、缺失株与互补株的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、黏附侵袭能力、胞内存活能力、动物致病力等生物学特性差异。结果表明,evf C基因缺失不影响APEC的生长速度、运动性、生物被膜形成能力、黏附侵袭能力。然而,缺失evf C可导致APEC在HD-11胞内存活能力及对雏鸭的致病力降低。本研究为阐述APEC T6SS2的致病作用提供了参考依据。     

双组分系统CpxR影响禽致病性大肠杆菌的耐药性、抗血清杀菌能力及毒力

CpxR是细菌中Cpx双组分系统（two component system,TCS）的反应调控蛋白,通过调控靶基因的转录表达,在细菌细胞膜稳定及毒力方面发挥作用。本研究旨在探究TCS CpxR对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）基本生物学特性、抗血清杀菌能力及致病性的影响。利用Red同源重组系统及互补质粒构建cpxR基因缺失株、互补株,然后比较分析野生株、基因缺失株与互补株的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、药物敏感性、抗血清杀菌能力、动物致病性的差异。结果显示：cpxR基因缺失株与野生株、互补株的生长速度和运动性能无明显差异,且缺失cpxR基因不影响APEC的生物被膜形成能力。然而,缺失CpxR导致APEC对阿米卡星和卡那霉素耐药性降低。血清杀菌试验结果显示,CpxR有助于APEC的抗血清杀菌能力。动物感染试验结果显示,野生株、cpxR基因缺失株和互补株对雏鸭的半数致死量（LD₅₀）分别为7.50×10⁵、7.50×10⁶、1.33×10⁶ CFU,表明CpxR缺失显著降低APEC的毒力。综上表明,TCS CpxR在APEC耐药性、抗血清杀菌能力及毒力方面发挥作用,为阐明APEC的环境适应性、生存能力及致病机制提供参考。     

APEC强毒力岛核心基因irp2、fyuA敲除对其致病性影响的研究

采用Red同源重组技术分别构建出APEC irp2单基因敲除株△AE17和irp2、fyuA双基因敲除株△△AE17。运用活菌计数法分别观察AE17、△AE17、△△AE17黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力。并且应用Real-time PCR检测AE17、△AE17和△△AE17中的luxs,pfs,tsh,ibeA,stx2f,iss,ompA,fimC 8个毒力基因转录水平。结果成功构建出基因敲除株△AE17和△△AE17,它们黏附DF-1细胞的能力分别下降为AE17的66.04%和53.54%。同时,Real-time PCR结果显示,△AE17的luxs,iss,ompA和fimC等4个毒力基因的转录水平均极显著下降(P<0.01),△△AE17的luxs,pfs,tsh,iss,ompA和fimC等6个毒力基因的转录水平极显著的下降(P<0.01)。结果表明强毒力岛中核心基因的敲除能够减弱APEC黏附DF-1的能力,并且使其毒力基因的转录水平有所降低。irp2、fyuA双基因敲除较irp2单基因敲除对APEC的致病性影响更显著。     

Ⅰ型群体感应系统对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成的调控机制研究

为进一步探析大肠杆菌Ⅰ型群体感应系统(QS-Ⅰ)对生物被膜(BF)形成能力的影响,研究构建可合成内源性QS-Ⅰ酰基高丝氨酸内酯(AHL)的大肠杆菌,模拟自然界中禽致病性大肠杆菌(APEC)受外源AHL调控的独特现象,分别通过玻璃试管气液交界面壁、聚苯乙稀材料表面、玻璃平面等不同环境下生物被膜形成能力,检测QS-Ⅰ对APEC BF形成能力的调控,并通过荧光定量PCR的方法检测相关基因,对调控机制进行初步探讨。结果显示,QS-Ⅰ系统抑制APEC菌株的生物被膜形成能力,且BF的形成不受鞭毛因素影响,APEC菌株可能通过QS-Ⅰ对QS-Ⅱ的抑制来间接调控BF的形成。研究结果提供了研究APEC毒力调控的新视角。     

Ⅵ型分泌系统分泌蛋白ClpV对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究clpV对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组构建了APEC DE17株的clpV缺失株DE17ΔclpV及其回补株DE17CΔclpV,比较分析了野生株、缺失株和回补株的生长曲线,运动性和生物被膜(BF)形成能力;对DF-1细胞的黏附、侵入能力以及通过荧光定量PCR检测clpV缺失后对Ⅵ型分泌系统(T6SS)相关基因转录水平的影响。结果显示,通过Red同源重组构建了clpV基因缺失株与回补株,利用分光光度计测OD600nm绘制野生株、缺失株和回补株的生长曲线。结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV生长速率无明显变化;其运动和BF形成能力的检测结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV的运动能力降低(p0.05),而其BF形成能力则升高(p0.05);分别将DE17、DE17ΔclpV和DE17ΔclpV感染DF-1细胞,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV对DF-1细胞的黏附能力升高(p0.01),而侵入能力减弱(p0.01)。荧光定量检测结果显示,与野生株相比,clpV缺失株csgD、icmF、lip和hcp基因的转录水平升高(p0.05),而vgrG和rpoD基因的转录水平降低(p0.05)。本研究结果表明,T6SS的分子伴侣ClpV影响APEC的生物学特性,为进一步研究T6SS的功能及其致病机制提供参考。     

禽致病性大肠杆菌luxS和rbsC双基因缺失株的构建及其生物特性分析

禽致病性大肠杆菌(APEC)能引起家禽严重的呼吸系统和全身性疾病,由于APEC耐药菌株的不断出现迫使新型抗菌方式的研发迫在眉睫。本研究旨在评价APEC的luxS和rbsC双缺失的突变株作为减毒疫苗候选株的潜力,通过在APEC分离株DE17的单基因缺失株DE17ΔluxS的基础上,利用Red重组系统构建双基因缺失株DE17ΔluxSΔrbsC,并对其生物学特性进行了分析。结果显示:rbsC的缺失不影响DE17ΔluxS的生长特性和生物被膜形成能力,但运动性显著降低;与DE17ΔluxS相比,DE17ΔluxSΔrbsC的黏附能力和入侵能力分别降至46.92%和28.78%;半数致死量(LD50)结果显示,毒力下降了115.5倍;肝脏、脾脏和血液中的载菌量分别下降了3.63倍、79.20倍和2124.41倍。根据以上结果推测,rbsC基因的缺失会进一步降低DE17ΔluxS的毒力,本文为评价DE17ΔluxSΔrbsC株减毒机制提供参考。     

伴侣蛋白Hfq对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究小RNA(sRNA)伴侣蛋白Hfq在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染致病过程中的作用,本研究采用Red同源重组法构建了禽致病性大肠杆菌FY26的hfq缺失株FY26Δhfq,通过测定缺失株生长曲线、生物被膜形成、体内定殖、胞内存活等能力来判定sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC致病力的影响。在体外,生物被膜形成能力直接决定着细菌对外界环境的抵抗能力,而在细菌进入体内后,其生长速率、黏附、定殖、吞噬细胞内的存活等能力均会直接影响其致病力。在进行了缺失株FY26Δhfq与野生株FY26的生长曲线测定试验、生物被膜形成能力测定试验、感染雏鸡试验、雏鸡体内定殖与侵袭试验、DF-1细胞黏附及HD11吞噬细胞内存活试验后,结果表明：hfq缺失株相较野生株其生长速率下降,生物背膜形成能力降低了18.6%,感染雏鸡时毒力降低,感染7 d后存活率为80%,在雏鸡体内定殖侵袭减弱,体内竞争能力下降至33.2%,对DF-1细胞的黏附能力降低,HD11吞噬细胞内的存活能力下降,单个细胞内存活的细菌数大多少于6个。研究表明,sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC的致病力起着关键的正向调控作用。     

禽致病性大肠杆菌双组分系统phoP/Q对鞭毛Ⅲ型分泌系统基因的调控预测

本研究旨在探究禽致病性大肠杆菌(APEC)中双组分系统phoP/Q与鞭毛Ⅲ型分泌系统(鞭毛T3SS)蛋白之间的联系。运用软件进行功能分析,预测phoP/Q与鞭毛T3SS的关系,利用基因芯片技术对APEC野生株和ΔphoP/Q缺失突变株进行转录组的差异性比较,筛选鞭毛T3SS基座中变化较大基因,并用荧光定量PCR检测基因表达变化量。结果显示:经STRING预测发现phoP/Q可能通过调控鞭毛T3SS基因座附近的双组分系统来间接调控鞭毛T3SS。基因芯片筛选与荧光定量PCR检测发现phoP/Q缺失能使鞭毛T3SS核心组件的大部分基因表达差异显著,同时也影响了双组分中motA、motB与cheY的表达。本研究对phoP/Q双组分系统与鞭毛T3SS的关系进行了预测与探索,为进一步研究揭示细菌的活动与致病机制提供了新的切入点与研究方向。     

禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究六型分泌系统2（type VI secretion system 2，T6SS2）clpV2基因对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC） TW-XM菌株生物学特性的影响。本研究利用Red同源重组构建clpV2基因缺失株，将clpV2基因克隆到表达载体pBR322中，成功构建回补株。对突变株的部分生物学特性进行分析。结果显示：各突变株均能稳定遗传，且clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性，但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。综上表明，clpV2基因的缺失会影响TW-XM菌株的部分生物学特性，为进一步研究clpV2基因的功能和APEC的致病机制奠定基础。     

肠炎沙门菌非编码小RNA RyhB-1和IsrE对清远麻鸡的致病性

RyhB是一种大小为90bp左右的细菌非编码小RNA,已有研究表明存在于鼠伤寒沙门菌和霍乱弧菌中的2种RyhB同源物RyhB-1和IsrE可调控细菌生物膜形成、趋化性和耐酸性。为研究RyhB在肠炎沙门菌致病性上的作用,以及2种同源物能否对毒力调控发挥协同作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了ryhB-1和isrE单、双缺失株,利用表达载体pBR322和pACYC184分别构建了回补质粒并导入缺失株50336△ryhB-1,50336△isrE,50336△ryhB-1/△isrE中,获得各突变株相应的回补菌株,检测了野生株和各突变株对1日龄雏鸡半数致死量(LD50)、致死率、体内分布等致病性差异。结果发现,ryhB-1和isrE基因缺失后导致肠炎沙门菌毒力减弱,双基因缺失株毒力下降更为明显,表明2种小RNA均对肠炎沙门菌致病性具有增强作用,且二者对毒力的调控具有协同作用。     

利用基因芯片筛选禽致病性大肠杆菌中与phoP/Q二元调控系统相关的耐药基因

为筛选禽致病性大肠杆菌(APEC)中与phoP/Q二元调控系统相关的耐药基因表达谱情况并对耐药相关基因进行分析,本实验采用基因芯片技术对APEC野生株和△phoP/Q基因缺失突变株进行转录组的差异性比较,结果检测到713个差异表达基因,其中403个基因的表达水平上调,310个基因的表达水平下调。这些基因涉及生物过程、细胞组分、蛋白质分类及调控通路等功能,本研究着重从上述差异基因中筛选出了aphA、parE等耐药相关的功能基因。本研究对phoP/Q二元调控系统与APEC耐药调控的相关性进行了探索与分析,为进一步深入探寻APEC耐药性的调控机制提供了新的切入点与研究靶标。     

奶牛乳腺源大肠杆菌NJ17 crp基因缺失株的构建及其生物被膜形成能力分析

为探究crp基因对奶牛乳腺源大肠杆菌生物学特性的影响,以奶牛乳腺源大肠杆菌NJ17为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,成功构建NJ17crp基因缺失株(NJ17-Δcrp)。对大肠杆菌野生株NJ17及crp基因缺失株的生长速率和生物被膜形成能力进行检测。结果表明,crp基因缺失影响奶牛乳腺源大肠杆菌NJ17的生长速率,生物被膜形成能力显著降低(P0.05)。