山东省副猪嗜血杆菌分子流行病学调查及其外膜蛋白P2基因的表达纯化

根据副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白(outer membrane proteins,Omp)P2基因序列(GenBank登录号:FJ685754.1)设计引物,对2015～2016年在山东省不同地区采集的225份病料进行PCR扩增和遗传演化分析,结果发现2015年和2016年Hps检出阳性率分别为7.63%、7.48%,细菌分离确定225份样品中17份为阳性;Hps菌株之间的氨基酸同源性在86.7%～99.7%,同源性较高的蛋白具有交叉反应性。构建Hps omp P2基因原核表达载体,确定OmpP2蛋白的最佳诱导温度,通过亲和层析Ni-IDA树脂纯化,获得高纯度的OmpP2蛋白,Western blot确定纯化的OmpP2蛋白与不同血清型的Hps阳性血清均存在良好的反应原性。本研究为进一步探索Hps OmpP2的生物学特性及对副猪嗜血杆菌病的血清学诊断、亚单位疫苗的开发奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其OmpP5基因序列分析

为研究辽宁省副猪嗜血杆菌(Hps)OmpP5基因的遗传变异规律,从辽宁省阜新市某猪场疑似患有副猪嗜血杆菌病的患猪肺部采取组织病料进行细菌分离,通过革兰染色、生化鉴定、卫星现象及Hps 16S rRNA PCR检测,鉴定为副猪嗜血杆菌。根据已发表的Hps OmpP5基因设计1对特异性引物,对分离株OmpP5基因进行扩增、克隆及测序,得到长度为1 116bp的OmpP5基因序列。将该序列与已发表Hps参考株的OmpP5基因进行同源性比对及系统发育树分析,发现核苷酸同源性为89.8%~99.5%,分离株与参考菌株№4在同一分支,表明OmpP5基因具有一定的保守性,分离株和№4亲缘关系较近。研究结果为阐明辽宁省Hps毒力基因及致病机理提供了参考依据。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2的提取及鉴定

为简化副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）外膜蛋白中的单一蛋白外膜蛋白P2（OmpP2）的分离步骤,降低膜蛋白分离的设备要求,本试验用Hps标准3型（SW114）、5型（Nagasaki）菌株作为试验材料,选用溶菌酶、核酸酶对Hps进行酶解以获得其完整外膜,然后利用含有2% tritonX-100缓冲液对外膜进行进一步解离,最后利用适量浓度的胰酶对强疏水蛋白进行酶解,实现了Hps高纯度OmpP2的体外快速提取。SDS-PAGE结果显示,上述2株菌OmpP2大小分别约为43和38 ku;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF）鉴定结果显示,从上述蛋白酶解下来的肽段经比对与Hps的OmpP2完全吻合。斑点杂交（Dot-blot）显示采自Hps患病猪血清在点有5型菌株（Nagasaki）OmpP2和点有3型菌株（SW114）OmpP2 NC膜上均发生杂交显色反应,该结果暗示OmpP2是一个具有免疫活性的抗原。本研究为OmpP2功能及免疫保护性研究奠定了基础,也为副猪嗜血杆菌病免疫学诊断提供新的参考。     

副猪嗜血杆菌毒力因子研究进展

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是引起猪革拉泽氏病(Glsser’s disease)的病原,能在特定的条件下侵入机体而引起严重的全身性疾病,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征。副猪嗜血杆菌的毒力因子仍不十分清楚。H.parasuis的全基因组测序工作的完成和遗传操作系统的建立极大促进了毒力因子、致病机制和基因功能的研究。近年证实了H.parasuis的外膜蛋白(Omp)和脂多糖(LPS)与毒力有一定的联系,特别是OmpP2、OmpP5和LPS的庚糖基转移。为了进一步鉴定毒力因子,利用在体外模拟体内感染环境和比较基因组学等方法鉴定了H.parasuis潜在的毒力因子。论文对H.pa-rasuis的毒力因子进行综述,以供参考。     

猪链球菌-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗在小鼠的免疫效力分析

本研究旨在开发一种用于防制猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病的新型二联基因工程疫苗,并对其免疫效应进行评价.选择猪链球菌2型蛋白溶血素SLY、HP0197和副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15和HPS06257 4种蛋白,重组表达并纯化,添加一定比例的佐剂制成含有不同组分的亚单位疫苗.研究表明该二联亚单位疫苗及各单苗能够引起小鼠良好的体液免疫,并能保护机体分别抵抗致死剂量猪链球菌2型(SS2)和副猪嗜血杆菌(HPS)强毒株的攻击.此外,调理吞噬试验表明疫苗高免血清能够有效杀死细菌,并赋予机体被动抵抗SS2和HPS感染的能力.研究证实制备的猪链球菌-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗在小鼠具备良好的免疫保护效力.     

副猪嗜血杆菌OmpP2刺激猪肺泡巨噬细胞炎性因子mRNA转录及致炎机制初步分析

为了研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)弱毒株11型H465株OmpP2刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs)炎性因子mRNA的转录和对NF-κB和MAPKs信号通路的影响,提取并纯化HPS血清11型H465株的OmpP2,分别用5、10μg·mL-1 OmpP2刺激PAMs 6、12h后收集细胞,提取总RNA和蛋白质。将提取的RNA反转录成cDNA,运用RT-PCR检测炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA转录水平。利用Western blot方法检测ERK1/2、JNK、P38、P65和IκBα蛋白表达量的变化。结果表明:HPS H465株的OmpP2能够显著地诱导IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平上调(P0.05),同时能够引起JNK、P65蛋白表达水平显著升高和IκBα蛋白表达水平显著降低(P0.05)。上述结果证实了HPS血清11型H465株的OmpP2能够通过调节MAPKs信号通路中JNK蛋白以及NF-κB信号通路中P65蛋白和IκBα蛋白降解促进炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的转录。     

副猪嗜血杆菌OmpP2基因的克隆及生物学信息分析

为了研究副猪嗜血杆菌外膜蛋白OmpP2基因的结构特征及编码蛋白的功能,根据GenBank中HPS OmpP2基因的DNA序列设计引物,以HPS血清13型江西分离株的基因组为DNA模板,利用PCR扩增OmpP2基因,并将其克隆到pMD18-T载体,进行测序及生物信息学分析。结果表明,此序列编码364个氨基酸,与GenBank上登录的OmpP2序列核苷酸同源性为98.7%~100%,其中与湖北F641株的同源性最高,达到100%;蛋白质的分子理论值为39.14ku,理论等电点为9.14;第1位~第20位氨基酸残基组成信号肽,属于分泌型蛋白;所编码的蛋白属于亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主。研究获得了HPS OmpP2基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌毒力因子的研究现状

副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害我国养猪业发展的新发细菌性传染病,我们对其毒力因子的了解却很少。为了更加全面地认识该病原体,作者对副猪嗜血杆菌各种因素与菌株毒力的关系做了简要的介绍。其中重点介绍了血清型与毒力的关系,较为全面地概述了巴氏杆菌科毒力相关因子荚膜、菌毛、脂多糖、外膜蛋白以及酶类与副猪嗜血杆菌毒力的关系,并认为神经氨酸酶是副猪嗜血杆菌重要毒力因子。副猪嗜血杆菌的毒力因子的研究是副猪嗜血杆菌病研究的一个重要方向。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因在猪肺泡巨噬细胞中的表达

为了进一步研究副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的功能,根据已发表的副猪嗜血杆菌核苷酸序列,设计并合成1对引物,PCR扩增HPS LZ株外膜蛋白ompP2基因,获得大小为1 158bp的核苷酸片段,该片段纯化后克隆至pEASY-Blunt载体,转化后鉴定,再与真核表达质粒pCI-neo经过酶切和连接反应,转化感受态大肠杆菌Trans-T1,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。通过脂质体法将pCI-neoompP2转染猪肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测重组质粒是否表达。结果显示,成功构建了含ompP2基因的副猪嗜血杆菌真核表达载体pCI-neo-ompP2,提取转染该质粒的猪肺泡巨噬细胞的mRNA,进行RT-PCR扩增,在1 000bp~2 000bp之间可见1条明显的条带。Western blot发现在42ku处出现目的条带。试验结果为后期研究副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的机理奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌热休克蛋白70基因的序列分析及抗原性鉴定

本研究利用简并引物首次从副猪嗜血杆菌基因组DNA中克隆获得全长HSP70基因(登录号:EU69-3116),基因测序结果表明HSP70完整阅读框1 908 bp,根据编码序列推导出相应635个氨基酸.经BLAST分析表明,其氨基酸序列与溶血性曼氏杆菌、杜克雷嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等同源性最高,达到90%左右.将HSP70部分基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,经酶切鉴定正确后转化感受态大肠杆菌BL21,以异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白.SDS-PAGE表明表达的重组蛋白约46 l(u,将表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清.Western blot结果显示该融合蛋白与副猪嗜血杆菌人工感染猪血清以及原核表达蛋白免疫的小鼠抗血清反应后有明显的特异性条带,证明该重组蛋白具有良好的抗原性,为HSP70功能研究奠定了重要基础.