禽流感RT—PCR诊断法的建立

根据禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｅｓｌｉｎ／１９０２（Ｈ７Ｎ７）株的血凝素（ＨＡ）基因参考序列设计合成一对Ｈ７ＨＡ特异引物,并应用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒ＲＮＡ,建立了逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＩＶＲＮＡ的方法,应用此法对鸡胚培养ＡＩＶ尿囊液,ＳＰＦ感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩莠试验和电镜技术作了对比,特异性试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）,传染性氏囊病病毒（ＩＢＤ     

应用RT—PCR技术扩增禽传染性支气管炎病毒S1基因的研究

选择Ｓ１基因做为目的基因,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术分别扩增１２株以非免疫鸡胚繁殖并通过超速离心浓缩的鸡胚尿囊液中的ＩＢＶ,所用引物为ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列,跨幅为１．７２ｋｂ。结果６株ＩＢＶ毒株（ＳＡＩＢ３、Ｆ、Ｄ４１、Ｈ５２、Ｈｏｌｔｅ）扩增出了长约１．７ｋｂ的Ｓ１基因片段,而另６株ＩＢＶ毒株虽经４次ＲＴ－ＰＣＲ重复后也显阴性。用ＨａｅⅢ内切酶对６个毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物     

应用RT-PCR技术扩增禽传染性支气管炎病毒S_1基因的研究

选择Ｓ１基因做为目的基因,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术分别扩增１２株以非免疫鸡胚繁殖并通过超速离心浓缩的鸡胚尿囊液中的ＩＢＶ,所用引物为ＩＢＶＢｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列,跨幅为１．７２ｋｂ。结果６株ＩＢＶ毒株（ＳＡＩＢ３、Ｆ、Ｄ４１、Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈｏｌｔｅ）扩增出了长约１．７ｋｂ的Ｓ１基因片段,而另６株ＩＢＶ毒株虽经４次ＲＴ－ＰＣＲ重复后也显阴性。用ＨａｅⅢ内切酶对６个毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行酶切,结果显示Ｍ４１、Ｈ５２、Ｄ４１３个ＩＢＶ毒株的Ｓ１基因包含两个ＨａｅⅢ位点,Ｆ株与Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因包含１个ＨａｅⅢ位点,而ＳＡＩＢ３株Ｓ１基因则已丢失ＨａｅⅢ位点。实验结果表明：运用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测ＩＢＶ时,由于Ｓ１基因的核酸序列具有较高的变异率,因此Ｓ１基因不宜做为目的基因。     

用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气 …

将ＩＢＶＴ株基因组Ｓ１基因上０．６kb片段（位于Ｓ１基因上１１２１bp～１７２３bp之间）克隆到ＰＩＢ－ＰＣＲ Ｃloning vector中,用地高辛标记探针,分别与９株ＩＢＶ 的ＰＣＲ产物和１２株ＩＢＶ的核酸进行点杂交均呈阳性反应,而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＲＮＡ,ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液的抽提物反应。探针检测ＩＢＶ－ＰＣＲ产物的灵敏度为１００～２００pg。用该探针检测不同毒株ＩＢＶ在鸡胚中的繁     

RT-PCR检测禽传染性支气管炎病毒

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ,分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０、２２８、６０２ｂｐ的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、Ｃｏｎｎ、Ｇｒａｙ、Ｔ、Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒、上毒、云毒、ＨＫ、１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果除Ｈｏｌｔｅ株和２个分离株（宜毒、云毒）外,其余均成功地扩增出６００ｂｐ的片段。用１．７、０．２、０．６ｋｂ３对引物对６个ＩＢＶ毒株和６个分离株的含毒尿囊液在相同和不同条件下进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果３对引物分别扩增出３、５、９株ＩＢＶ,同时可将不同血清型的１２个ＩＢＶ株分成６种基因型。将ＩＢＶ分离株ＨＫ与标准株Ｍ４１经ＰＣＲ扩增、ＨａｅⅢ和Ｈｉｎｄ酶切、ＲＦＬＰ分析,表明属同一马萨诸塞血清型。３株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）在鸡胚中繁殖,ＰＣＲ最早检出的时间为２０～２４ｈ。ＲＴ－ＰＣＲ提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测病毒的新方法。     

用单抗介导的荧光抗体技术检测鸡尿囊细胞内传染性支气管炎病毒的研究

用传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、ＡＲＫ、澳大利亚Ｔ株、野外分离株ＲＳ、ＲＹ及鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ），鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）、减蛋综合症病毒（ＥＤＳＶ）等分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，３７℃孵育４８小时后，将其尿囊液离心，沉淀用ＰＢＳ悬浮，涂片，用抗ＩＢＶ单抗ＭＣ作一抗、进行间接荧光抗体检测。结果：Ｈ１２Ｏ、Ｈ５２、Ｍ４１“ＡＲＫ、Ｔ株及ＲＳ、ＲＹ均显阳性，而ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＥＤＳＶ均为阴性。结果表明、用此法检测鸡胚尿囊液中ＩＢＶ．具有快速、敏感、特异的优点。     

巢式PCR快速鉴定鸡传染性支气管炎病毒的研究

鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）经鸡胚增殖后,直接用尿囊液提取ＲＮＡ后反转录成ｃＤＮＡ,用ＩＢＶ基因３’端的ＵＴＲ１－／ＵＴＲ２＋和ＵＴＲ３－／ＵＴＲ４＋两对引物进行巢式ＰＣＲ,所检测的４个ＩＢＶ标准参考株和１６个ＩＢＶ野毒株均得到了预期的１７４ｂｐ大小的片段,而鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）,鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）及正常鸡胚尿囊液经同样处理没有可见片段出现。本试验不需纯化册毒只需０５ｍｌ病毒尿囊液即可在２４小时内得到准确的试验结果。这表明与其它ＩＢＶ鉴定方法相比,该法具有快速、灵敏、特异的优点。     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

H14亚型禽流感病毒核蛋白基因的扩增与克隆

本研究直接从浓缩的鸡胚尿囊液中提取Ｈ１４禽流感病毒的ＲＮＡ,并根据已发表的Ａ型流感病毒株的核苷酸序列,设计一对引物,采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术成功地扩增了ＡＩＶ的核蛋白（ＮＰ）基因,以ｐＵＣ１１９为载体,以大肠杆菌ＪＭ８３为受体菌,并通过限制性分析证实,成功地克隆了该ＮＰ基因     

H14亚型禽流感病毒核蛋白基因的扩增与克隆

本研究直接从浓缩的鸡胚尿囊液中提取Ｈ１４禽流感病毒的ＲＮＡ,并根据已发表的Ａ型流感病毒株的核苷酸序列,设计一对引物,采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术成功地扩增了ＡＩＶ的核蛋白（ＮＰ）基因,以ｐＵＣ１１９为载体,以大肠杆菌ＪＭ８３为受体菌,并通过限制性分析证实,成功地克隆了该ＮＰ基因。