传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律.对不同代次细胞毒序列分析的结果表明,细胞毒在第8代以前,VP5基因序列没有改变,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达98%以上;细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达99%;细胞适应毒传至20代,其VP5基因序列不再改变.从而说明,vvIBDV Gx株VP5基因在致弱过程中存在变化规律.     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP3基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV Gx株进行培育，通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱，对其结构蛋白VP3基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析，从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律。对不同代次细胞毒序列分析的结果表明，细胞毒在第8代以前，VP3基因序列没有改变，与标准超强毒HK46株氨基酸同源性达99％以上；细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变；10代毒VP3基因与标准弱毒P2株氨基酸序列同源性达100％；细胞适应毒传至20代，其VP3基因序列不再改变。从而说明，vvIBDV Gx株在致弱过程中，VP3基因也随之改变。     

传染性法氏囊病病毒中间株有关特性的研究

CEF－9是传染性法氏囊病病毒超强毒株vvIBDV-Gx在鸡胚成纤维细胞上传代致弱过程中的第9代毒。我们对其分子生物学及生物学特性进行了研究，结果表明其VP2基因序列即具有超强毒的特性，又兼有部分致弱毒的特征；其致病性介于超强毒株和致弱株之间；在体内外均不稳定的，体外继续传代可继续致弱，回归体内可迅速返强。这说明CEF－9是vvIBDV驯化时，毒力强弱转化的中间过渡形式。     

安徽地区IBDV超强毒株的分离鉴定和VP2基因序列分析

经鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种、易感鸡接种试验、电镜观察,从安徽地区疑似病鸡的法氏囊组织分离到3株传染性法氏囊病毒。分离株人工感染4周龄鸡,致死率分别为92%、83%、67%。接种9～10SPF鸡胚测得的鸡胚半数致死量(ELD50)分别为10-6.8/0.2mL、10-5.4/0.2mL、10-4.6/0.2mL。应用Nested-PCR分别对3株分离株VP2基因高变区进行克隆测序和序列分析,结果表明:3个分离株与国内外参考超强毒株的核苷酸同源性为97.2%～99.5%,氨基酸同源性为99.3%～100%,VP2高变区核苷酸和推导的氨基酸符合传染性法氏囊病病毒超强毒株特征。     

IBDV超强毒GX8/99株的细胞适应毒和鸡体传代毒的致病性和VP5基因的比较

传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Diseas Virus,IBDV)的超强毒株GX8/99经在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续盲传23代后,细胞适应毒株GXC23时鸡的致病性显著减弱,对4～6周龄SPF鸡的致死率从85%～90%减为0～5%.GXC23在96孔细胞培养板上经2次无限稀释法后得到3个克隆病毒.经SPF鸡回传20代后,相应的毒株GX-2820、GX-4820、GX-5820对SPF鸡的致死率仍维持在0～5%.序列比较表明,GX8/99在传代过程中,其细胞适应毒GXC23有8个碱基突变,其中5个碱基突变导致了氨基酸改变.bp#2 T→C突变,导致传代毒ORF中的起始编码子后移了4个氨基酸.而3个克隆化病毒回鸡20代后致病性不变,这几个位点也保持不变,且与3个疫苗株完全一致.进一步分析表明,有4个超强毒株和4个强毒株的VP5基因的5个位点与GX8/99原始毒相同,而另3个超强毒及6个强毒株与细胞适应毒GXC23一致.这些结果表明,超强毒GX8/99在细胞传代过程中VP5基因上5个氨基酸的变异主要与适应细胞培养相关而与致病性无关.     

鸡传染性法氏囊病毒JS株毒力测定

35日龄SPF鸡半数致死量(LD50)和9日龄SPF鸡胚半数致死量(ELD50)试验结果显示,传染性法氏囊病毒(1BDV)JS株的LD50为10-3.60.1 mL/只,ELD50为10-5.20.1 mL/胚;1～6周龄SPF鸡及商品鸡的致病性试验结果显示,IBDV JS株对SPF鸡和商品鸡3周龄后的致病率为100%,最高致死率分别为93.75%和75%;应用RT-PCR方法从IBDV JS株中扩增的VP2基因,经序列测定分析结果显示,IBDV JS株的VP2基因与香港HK46、日本OKYM、英国UK661等国际超强毒株的氨基酸序列的同源性达99%以上.表明IBDV JS株为超强毒株.     

传染性法氏囊病病毒X毒株不同代次的致病性及VP2可变区序列分析

分别以传染性法氏囊病病毒（IBDV）X毒株细胞适应的第5代、第11代和第17代毒感染38日龄非免疫雏鸡进行致病性试验，确定X毒株的毒力，并比较3个代次毒的致病性差异，进而利用RT－PCR扩增其VP2基因可变区，测定其核苷酸序列，从分子生态学角度研究了非鸡胚源细胞传代培养对IBDV X毒株毒力和抗原性的影响。结果表明，BDV不X毒株表现为中等毒力，在Vero细胞上传代后，其毒力有所减弱。VP2可变区氨基酸序列有3个位置发生了替换，即第5代在酸残基262位为半胱氨酸，而第11代毒和第17代毒则变为酪氨酸（Cys→Tyr)；第5代毒的290位为缬氨酸，而第11代和第17代毒则变为蛋氨酸（Val→Met)；第5代毒和第11代毒的316位为赖氨酸，而第17代毒则变为精氨酸（Lys→Arg）。290位氨基酸替换导致该区域二级结构的改变，并对IBDV的抗原性有显著影响。上述结果提示，这些氨基酸残基可能对维持IBDV的毒力和抗原性是必要的。通过毒株间VP2可变区序列的比较和系统发生树的分析，证明IBDV X毒株与Bursin-2疫苗毒关系很近。     

超强毒IBDV GX8/99株不同传代毒致病性与VP5基因的关系分析

将vvIBDV GX8/99株原代毒、鸡胚毒、克隆化毒、回传SPF鸡10代次毒及克隆化细胞传20代次毒分别测定ELD50,以相同的ELD50病毒量分别接种SPF鸡,从而观察vvIBDV GX8/99株在传代过程中致病性的变化规律。同时分别提取病毒RNA,通过RT-PCR、PCR扩增、基因克隆、核苷酸序列测定和分析,对IBDV GX8/99株的24株不同传代毒的VP5基因进行比较,发现其同源性在94%～100%,并且有15个易发生变异的位点,其中位点bp#2、#8、#52、#145、#232、#272、#310、#364、#385、#409的碱基变异引起了相应氨基酸的改变,而位点bp#18、#285、#331、#354、#397的碱基变异没有引起相应氨基酸的变化。通过比较分析,可以看到在致死率由原代毒的86.7%降为GXE10的43.0%时VP5基因的核苷酸有4个位点发生了变异,致死率由GXE10的43.0%降为GXC23的3.3%时VP5基因的核苷酸有10个位点发生了变异;而将GXC23克隆化后的4株毒株致病性变化不大,并且仅在GXCL1-1的#8位点,GXCL2-1和GXCL4-1的#364位点发生变异;将4株克隆化毒株回鸡传10代后的致死率有一定程度的回升,且有2个位点发生变异;4株克隆化毒株在细胞上连续传20代后其致死率都降为0.0%,并且克隆株5没有发生核苷酸变异而克隆株1,2,4也仅有1个核苷酸位点发生变异。由此推论vvIBDVGX 8/99株的致病性与VP5基因某些氨基酸的变异有一定的关系,更可能与病毒对细胞的亲嗜性关系密切;这为探明vvIBDV毒力改变的分子基础,从而解释自然界中vvIBDV出现和致弱的原因提供了佐证。     

鸡传染性法氏囊病病毒弱毒株在鸡体连续传代后毒力增强的分子机理研究

将两株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）弱毒株在SPF鸡体内连续传代至第5、第6代时,出现明显的法氏囊萎缩和B：B指数下降,表明IBDV弱毒株在鸡体内连续传代后毒力增强。为进一步阐释哪些基因位点导致了上述毒力的变化,本试验测定了基础弱毒株及其在鸡体内传代后各个代次毒的基因组序列,比对分析后发现VP2蛋白253位氨基酸发生了由H到Q或N的变异,表明VP2蛋白253位氨基酸的替换可能会增强传染性法氏囊病病毒在鸡体内的致病性。     

传染性法氏囊病病毒X毒株不同代次的致病性及VP_2可变区序列分析

分别以传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) X毒株细胞适应的第 5代、第 1 1代和第 1 7代毒感染 38日龄非免疫雏鸡进行致病性试验 ,确定 X毒株的毒力 ,并比较 3个代次毒的致病性差异 ,进而利用 RT-PCR扩增其VP2 基因可变区 ,测定其核苷酸序列 ,从分子生态学角度研究了非鸡胚源细胞传代培养对 IBDV X毒株毒力和抗原性的影响。结果表明 ,IBDV X毒株表现为中等毒力 ,在 Vero细胞上传代后 ,其毒力有所减弱。VP2 可变区氨基酸序列有 3个位置发生了替换 ,即第 5代毒氨基酸残基 2 62位为半胱氨酸 ,而第 1 1代毒和第 1 7代毒则变为酪氨酸 ( Cys→ Tyr) ;第 5代毒的 2 90位为缬氨酸 ,而第 1 1代和第 1 7代毒则变为蛋氨酸 ( Val→Met) ;第 5代毒和第 1 1代毒的 31 6位为赖氨酸 ,而第 1 7代毒则变为精氨酸 ( Lys→Arg)。 2 90位氨基酸替换导致该区域二级结构的改变 ,并对 IBDV的抗原性有显著影响。上述结果提示 ,这些氨基酸残基可能对维持IBDV的毒力和抗原性是必要的。通过毒株间 VP2 可变区序列的比较和系统发生树的分析 ,证明 IBDV X毒株与 Bursin-2疫苗毒关系很近。     

Changes in VP2 gene during the attenuation of very virulent infectious bursal disease virus strain Gx isolated in China

Very virulent (vv) infectious bursal disease virus (IBDV) Gx strain with high pathogenicity was attenuated through replication in specific-pathogen-free (SPF) chicken embryos and in chicken embryo fibroblast (CEF) cell cultures. The changes in VP2 nucleotide and the deduced amino acid sequences were obtained during attenuation of vvIBDV in CEF culture. Sequence analysis of selected passages from numbers 0 to 20 in CEFs (designated here Gx to CEF-20) showed that no changes were detectable in the VP2 gene before CEF-7. There were a few changes in the nucleotide sequence of the VP2 gene but no amino acid substitutions at CEF-8. The virus of CEF-9 was an intermediate with some amino acid changes that possibly were related to virulence. CEF-10 virus had become similar to CU-1 strain. The VP2 gene sequence remained the same from CEF-10 to CEF-20. The results of pathogenicity tests showed that the mortalities of Gx, CEF-5, CEF-8, and CEF-9 in 4-wk-old SPF chickens were 64%, 60%, 60%, and 32%, respectively; whereas CEF-10, CEF-15, and CEF-20 were nonpathogenic. Virus neutralization tests with Gx strain showed that the antigenicities are similar from Gx to CEF-20.     

IBDV流行强毒HQ-b株与其细胞适应毒生物学特性比较及VP2、VP5基因序列分析

为了解IBDV流行强毒HQ-b株囊毒与其细胞适应毒间生物学特性差异及2毒株毒力变化与VP2、VP5基因变异的关系,对2毒株的细胞适应性、致病性等进行比较,同时对其VP2、VP5基因序列进行分析。结果表明,HQ-b株囊毒对CEF、CEK、CELi、DF-1和Vero均不适应,而细胞适应毒HQ株仅不能适应Vero细胞、且批内及批间毒价稳定。致病性结果显示HQ-b株对4周龄SPF鸡致死率高达80%,是真正的超强毒,而细胞适应毒致死率已降为0%。对VP2基因高变区研究表明,HQ-b株具备IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S;其细胞适应毒HQ株除222A→P、256I→V、294I→L和299S→N外,在VP2公认的毒力位点253(Q→H)、279(D→N)、284(A→T)位氨基酸也发生改变,导致细胞适应毒具备经典弱毒株的分子特征,即222P、256V、279N、284T、294L和299N。对VP5基因研究表明:流行强毒HQ-b株也具有IBDV超强毒株的分子特征;其细胞适应毒VP5基因有12个位点碱基突变并导致9处氨基酸变异,尤其是ORF区第2个碱基由"T"突变为"C"后,导致细胞适应毒VP5的N端丢失了4个氨基酸,这种突变与现有的疫苗毒完全一致。本研究提供了超强毒HQ-b培育、驯化后致病性和细胞适应性转变的分子机理,也丰富了IBDV分子流行病学的理论。     

传染性法氏囊病病毒Gt株基因组A节段的克隆和序列分析

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV-Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,使其成为弱毒株IBDV-Gt.从细胞适应毒中提取病毒dsRNA,通过反转录,使用Long-accurate PCR(LA-PCR)用一对引物一步直接扩增IBDV-Gt基因组A节段全长cDNA的方法,得到一约3.30kb的片段.测序结果证明已获得3255bp的A节段全长,对vvIBDV-Gx株和IBDV-Gt株的全部核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明IBDV-Gt株与国内外数株IBDV弱毒株的同源性在99%以上.     

鸡传染性法氏囊病病毒XX08株VP2高变区基因的克隆与序列分析

应用反转录(RT-PCR)技术从河南新乡某鸡场分离的鸡传染性法氏囊病病毒XX08株总RNA中克隆出593bp的VP2高变区基因。序列分析表明,XX08毒株VP2高变区氨基酸序列与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM以及经典弱毒株D78的同源性均为96.8%。遗传进化分析表明,该毒株与超强毒株UK661和OKYM位于同一进化树。XX08毒株与超强毒株具有相似的氨基酸特征,但是222位的A被P替代,提示XX08毒株可能为中等强毒力毒株。     

Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of VP2 Gene of Infectious Bursal Disease Virus C4 Strain

This study was aimed to investigate the relationship between the virulence characteristics of infectious bursal disease virus(IBDV) C4 strain and its VP2 amino acid sequence. The RNA of IBDV C4 strain was extracted,and its VP2 gene was amplified by RT-PCR.VP2 nucleotide sequences and deduced amino acids of different virulent IBDV strains were compared. At the same time, prokaryotic expression vector pET-32a(+) was used to express the VP2 gene. The expression of recombinant VP2 protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting. The results showed that the VP2 gene of IBDV C4 strain belonged to the very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) in evolutionary relationship, the VP2 nucleotides homology between IBDV C4 strain and other vvIBDV strains were 98.1% to 98.7%, and there were no mutations in S-W-S-A-S-G-S (326-332 amino acids) and 222(A), 256(I), 294(I) and 299(S). The VP2 amino acid sequence of IBDV C4 strain was consistent with the characteristics of other vvIBDV strains. However, there were three differences amino acids sites at 201(D/G), 281(G/R) and 313(V/A) between the amino acids of the C4 strain and the very virulent strain UK661. And the change of 281(R) was in the small hydrophilic region of 279 to 290, which was related to the antigenicity of the virus; The recombinant VP2 protein molecular weight expressed in Escherichia coli BL21 was about 67 ku. This study provided a basis for further research on antigenic changes resulting from amino acid variation of 201(G), 281 (R) and 313(A). These results indicated that the VP2 gene of the IBDV C4 strain was consistent with the major characteristics of the vvIBDV strain VP2 gene. The difference of three amino acid sites in the vvIBDV strain C4 might be related to the evolution of virulence of IBDV strain in China.     

Direct evidence of reassortment and mutant spectrum analysis of a very virulent infectious bursal disease virus

The complete genomic sequence of very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) Gx strain was determined, including the sequences of segment A, encoding the precursor polyprotein, and segment B, encoding the viral RNA polymerase (VP1) and 5'- and 3'-untranslating regions. Alignment of segment A of Gx with the sequences of 12 other vvIBDV strains showed 97.5% to 99.0% amino acid identity, whereas alignment of segment B of Gx with nine other vvIBDV strains revealed high sequence divergence, ranging from 10.3% to 11%. Phylogenetic analysis of segments A and B showed that they were in different branches, indicating that the reassortment occurred in this strain and that segment A and segment B derived from different pathotype strains. The mutant spectrum analysis of quasispecies virus demonstrated that the mean minimum mutation frequency in VP1 was 8.78-fold higher than in the polyprotein. The most frequent mutations were in the first 1986 nucleotides (nonsynonymous mutations) and the last 660 nucleotides (synonymous mutations), indicating that the 219 amino acid residues in the C-terminal of the VP1 form a functional region.     

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx与疫苗毒Gt在鸡体内的复制研究

本试验利用鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱疫苗毒Gt为对象,研究超强毒与弱毒株在鸡体主要免疫器官内的复制情况,以探讨两类毒株表现不同生物特性的原因。分别利用鸡胚半数致死量和鸡胚成纤维细胞半数感染量对超强毒Gx和疫苗株Gt进行病毒滴度的测定;再利用荧光定量RT-PCR对两类毒株进行病毒量的校准。以相同量的病毒对2周龄SPF鸡进行攻毒。攻毒试验表明超强毒Gx能造成47.5%的死亡,法氏囊、脾脏、胸腺等免疫器官均严重损伤;而疫苗毒Gt无致死,且未能造成任何病理可见的损伤。病毒的体内复制情况表明超强毒相对于疫苗毒复制更为迅速,病毒载量更高。