紫外-微波诱变选育抗菌肽高产菌株及抗菌肽性质分析

以抑制大肠杆菌能力为指标,采用紫外-微波诱变的方法对Tu-569菌株进行选育,并以遗传稳定性试验评价正突变菌株的稳定性,以获得抑菌能力更强、遗传更稳定的高产菌株;通过观察高产菌株的菌落和菌体形态,以生理生化试验和API 50 CH细菌鉴定条综合评测高产菌株生理生化特性,结合16S r DNA序列分析来鉴定高产菌株的种属;通过考察硫酸铵盐析、透析处理、蛋白酶处理、加热处理、缓冲液pH值等对突变菌株胞外产抑菌物质活性的影响,探索抑菌物质的性质。结果表明,于30 cm处紫外照射240 s时,筛选出1株抑菌圈面积增大0.79倍且传代十次遗传稳定的正突变菌株T-4M-5。选取T-4M-5菌株进行微波诱变,当微波炉参数为P50,辐射共60 s和70 s时,筛选出4株抑菌圈显著增大且遗传稳定的正突变菌株,其中T-70-1菌株的活性最高(抑菌圈面积达到363.8 mm2)且遗传稳定性最好,是Tu-569菌株抑菌圈面积的2.74倍。T-70-1菌株具有与Tu-569菌株相同的菌落菌体形态;除不产接触酶、可耐受10%和15%的Na Cl、可利用D-半乳糖和D-塔格糖外,其余生理生化特性与Tu-569菌株相同;结合16S r DNA序列分析鉴定T-70-1菌株为Bacillus velezensis。T-70-1菌株胞外抑菌物质可被70%饱和度的硫酸铵盐析;该抑菌物质相对分子质量在3.5~8.0 k Da之间;抑菌物质分子结构中含有可被胰蛋白酶或胃蛋白酶酶解的肽键;在pH值3.0~9.0范围内均有较高活性;抑菌物质对40~100℃加热处理具有较强耐受性,但121℃处理后完全失活。经紫外-微波诱变获得了一株高产抗菌肽、遗传稳定的T-70-1菌株,其胞外产抗菌肽抑菌活性较强,耐受胃肠道环境,较为耐热,在畜牧养殖业极具应用潜力。     

饲用木聚糖酶菌株的筛选及鉴定

利用刚果红透明圈法,从采集的土样中筛选分离一株产木聚糖酶的菌株,根据其形态学和生理生化特征,结合16 SrDNA分子水平分析,鉴定该菌为短小芽孢杆菌。摇瓶发酵粗酶液的性质测定表明,该菌株酶活力可达132.53 IU/mL。     

厨余中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

试验筛选厨余中具有高效降解淀粉功能的芽孢杆菌.采用可溶性淀粉培养基进行菌株的富集及分离培养,获得13株产淀粉酶的芽孢杆菌,测定其透明圈直径与菌落直径比值2.9～6.3,其中S8菌株和S10菌株产酶能力较高,总酶活达到283.6 U/mL和329.7 U/mL.通过形态、生化特征及16S rRNA基因序列分析,鉴定S8菌...     

高产谷氨酸脱羧酶的菌株筛选及鉴定

γ-氨基丁酸作为一种新型饲料添加剂,助推畜牧养殖业绿色健康发展。谷氨酸脱羧酶利用磷酸吡哆醛为辅因子将L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸的转化方法得到了广泛关注。本研究利用平板活性筛选结合摇瓶发酵复筛的方法,从宁夏沙漠土样中筛选获得了3株具有较高谷氨酸脱羧酶活性的菌株。通过对菌落形态、16S r DNA序列比对和系统发育树分析,3株菌初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),命名为Bacillus sp. Z1、Bacillus sp. Z11和Bacillus sp. Z20,保藏于中国农业微生物菌种保存中心。通过全基因组测序分析,发现三株菌分别含有一个谷氨酸脱羧酶编码基因。三条基因序列长度均为1 470 bp,序列相似性为94.5%～97.3%,编码489个氨基酸和1个终止密码子,理论分子量55 ku。     

一株枯草芽孢杆菌产抗菌肽培养基筛选及发酵工艺优化的研究

试验旨在对一株产抗菌肽枯草芽孢杆菌BL0006的发酵培养基和发酵条件进行优化,以提高发酵液中抗菌肽的效价。首先通过单因子试验筛选出培养基的最适碳源、氮源与无机盐分别为葡萄糖、蛋白胨和K_2HPO_4;在此基础上采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法得到培养基最佳配方:通过摇瓶单因素试验对发酵条件、温度、接种量、转速进行了优化,优化后的发酵培养基为葡萄糖47.7 g/L、蛋白胨29.0 g/L、K_2HPO_4 3.3 g/L,摇瓶发酵工艺为接种量30 mL/L、初始pH 7.5、摇床转速220 r/min、培养温度37℃。优化后抗菌肽的效价提高到了4.25×10~4 U/mL,是优化前的3.51倍。综合试验结果,本研究筛选的培养基和优化后的发酵工艺可达到高产、降低成本、缩短发酵时间的效果。     

土壤中芽孢杆菌的分离及初步鉴定

芽孢杆菌是一种耐高温、高压及低pH值的有益微生物.本试验从土壤中分离出4种细菌,经初步鉴定,判定该4种细菌均为芽孢杆茵属成员.通过进一步试验,了解到其部分生理生化特点及对几种药物的敏感程度,为芽孢杆茵在工农业生产中的应用及在基因工程中的研究与应用提供了一定的依据.     

鸡源芽孢益生菌的筛选及JM-11菌株的鉴定

为了筛选对鸡腹泻有治疗作用的益生菌,试验利用琼脂扩散法,以大肠杆菌菌株为病源指示菌,在鸡肠道内分离得到具有较强抑菌活性的颉颃细菌70株。利用发酵液平板打孔对其中24株进行复筛,得到1株颉颃活性较高的菌株JM-11。对该菌株进行形态特征的观察和生理生化试验,结合16SrDNA序列分析,并与相应种和属的菌株进行对比,表明JM-11与芽孢杆菌相应性状相近。用BLAST软件在Genbank数据库中对JM-11菌株的序列进行比对,经分析JM-11菌株与枯草芽孢杆菌的相似性水平达到100%,且二者在所构建的系统发育树上处于同一个分支。最终鉴定JM-11菌株为枯草芽孢杆菌。     

高产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究

为了从腐殖质土壤中筛选得到高产纤维素酶菌株,本试验进行了产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及其产酶特性研究。首先用羧甲基纤维素钠(CMA-Na)培养基初步分离产纤维素酶菌株,再经过酶活复筛得到一株高产纤维素酶菌株B17。经过形态学和16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并对其发酵产酶条件和酶学性质进行初步研究。试验结果表明,菌株B17的最佳发酵条件为:培养时间3 d、发酵温度35℃、初始pH为6.0,该条件下测得CMC酶活达85.48 U/mL、FPA酶活达59.85 U/mL。酶学性质研究表明:菌株所产纤维素酶最适反应条件为温度50℃、pH为6.0,且具在30～60℃、pH为4.0～7.0范围均具有较高酶活。以上结果表明,本研究所得菌株B17具有较高的开发价值,可应用于农作物秸秆饲料的生产。     

抗菌肽对抗生素耐药菌株的抑菌活性研究

[目的]研究抗菌肽对抗生素耐药菌株的抑菌活性。[方法]利用抗性平板划线法从腹泻病牛血便中筛选分离出1株耐药菌,通过16S rDNA序列进行鉴定,采用琼脂孔穴扩散法通过梯度盐酸壮观霉素（spectinomycin,Spe⁺）、氨苄青霉素（ampicillin,Amp⁺）、硫酸卡那霉素（kanamycin,Kan⁺）和氯霉素（chloramphenicol,Cm⁺）试验确定该菌药敏特性,并利用1种抗菌肽制剂对该菌株进行药敏试验。[结果]经BLAST比对分析该菌16S rDNA序列,鉴定该耐药菌为科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）,此菌对Amp⁺敏感,但对试验中其他抗生素均有耐药性,各梯度抗菌肽对该耐药菌均具有明显的抑菌活性。[结论]抗菌肽能有效抑制耐药科氏葡萄球菌的生长,有望在畜牧生产中代替抗生素使用。     

玉米赤霉烯酮降解菌株的筛选及鉴定

本试验旨在从土壤中筛选出能降解玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的菌株。将土壤中分离的菌株接种至含2μg/m L ZEN的LB液体培养基中,37℃,180 r/min,培养24 h。采用间接竞争ELISA法检测ZEN的残留量,计算菌株的ZEN降解能力。并将降解ZEN能力较强的菌株进行形态学、生化特性和16S r DNA基因序列分析鉴定。结果显示:筛选出的菌株JM-1降解ZEN的能力可达26.27%,显著高于其他菌株(P0.05)。经形态学、生化特性和16S r DNA基因序列分析,菌株JM-1鉴定为蜡样芽孢杆菌。     

鸡肠道芽胞杆菌的分离鉴定及产蛋白菌株的筛选试验

本试验从鸡肠道中分离出菌种50株,通过对菌种菌落培养特性、形态观察、生理生化实验,初步鉴定出8株为芽胞杆菌。经产蛋白菌株的筛选试验筛选出1株能够分泌蛋白的芽胞杆菌,该菌株可望成为外源蛋白高效分泌表达的宿主。     

具广谱抑菌活性乳酸菌的筛选

从传统发酵食品、市售酸奶中分离出78株乳酸杆菌,其中对B.subtilis和E.coli明显有抑菌活性的有58株。挑取抑菌效果较好的9株进一步研究。结果发现,菌株Lac8和Lac9产生的抑菌素pH作用范围比较广,在pH5～6的范围内仍有较强的活性;热稳定性也很好,加热不仅没有减弱其抑菌活性反而可促进其抑菌活性的发挥。虽然抑菌谱实验中两者对真菌都没有抑菌活性,但其对革兰氏阳性和阴性细菌都有强而稳定的抑菌活性,有进一步研究和工业应用的优良潜质。     

应用交叉拮抗法筛选产细菌素菌株的试验研究

应用交叉拮抗法从明串珠菌和片球菌菌株中筛选产细菌素菌株,获得了4株具有明显抑菌效果并对蛋白酶敏感的菌株,分别为乳酸明串珠菌9、乳酸片球菌、肠膜明串珠菌WZ30-2和肠膜明串珠菌WZ-9-2菌株.     

四川高效白三叶根瘤菌筛选及16SrDNA鉴定

为了筛选出与白三叶(Trifolium repens)共生匹配效果优异的根瘤菌菌株,从四川野外采集到80余份白三叶根瘤样品并从中成功分离出了72株。经菌落形态观察,革兰氏染色镜检初步检验后,对所分离的菌株进行水培法和砂培法结瘤试验筛选高效菌株。结果表明,接种根瘤菌显著提高了白三叶的结瘤数、株高、鲜重、干重、叶绿素和全氮含量(P< 0.05),其中以菌株YA1121和CD1105为最佳。同时,采用16S rDNA序列鉴定菌株YA1121和CD1105,属于三叶草根瘤菌,为四川白三叶根瘤菌遗传多样性及系统发育研究奠定了基础。     

猪链球菌血清9型菌株分离鉴定及强毒株筛选

为了筛选猪链球菌血清9型(SS9)强毒株并研究其生物学特性,对全国各地发病猪的病料中进行猪链球菌分离培养。通过形态学观察、革兰氏染色镜检、PCR鉴定及血清型分型确定了29株猪链球菌血清9型菌株,分别命名为SS9-1～SS9-29。通过玉米大蜡螟幼虫和Balb/c小鼠对29株猪链球菌血清9型菌株进行初筛和复筛,筛选出2株猪链球菌血清9型强毒株,分别为SS9-20、SS9-22。为进一步了解SS9-22的生物学特性,对其进行生长曲线绘制、毒力基因检测及小鼠致病性试验。结果显示,SS9-22菌株在37℃培养6 h时,菌液密度可达到最高值。毒力基因检测发现SS9-22的毒力基因型为gapdh⁺/sly⁺/fbps⁺/orf2⁺/mrp~﹣/89K~﹣/gdh⁺/epf⁺。SS9-22菌株经腹腔接种Balb/c小鼠,24 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、被毛耸立、运动迟缓、死亡等临床症状,该菌株的LD₅₀为3.2×10⁷CF...     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。     

鸡源耐镉乳酸菌株的分离与鉴定

本试验旨在从鸡肠道中分离筛选出耐镉(Cd)的乳酸菌,为将其开发应用于防控家禽饲料重金属Cd污染提供理论基础。取鸡肠道内容物的样品进行乳酸菌分离,以耐受100 mg/L的Cd为标准筛选乳酸菌,采用分子生物学方法鉴定菌株。对筛选出的乳酸菌株进行生长性能、耐Cd性能及Cd吸附性能等测定。结果表明：本试验共筛选出5株耐Cd乳酸菌,分别为1株约氏乳杆菌Cd3-1和4株卷曲乳杆菌Cd1-1、Cd5-2、Cd4-5和Cd8-2。其中Cd3-1、Cd5-2和Cd8-2菌株最高可耐受1 000 mg/L的Cd,而Cd1-1和Cd4-5菌株最高可耐受400 mg/L的Cd。各菌株对50 mg/L Cd的吸附率随溶液pH的升高而增加,在pH为6.0和7.0时Cd的吸附率均显著高于pH为2.6时Cd的吸附率(P<0.05)。5株乳酸菌均可耐受0.3%的胆盐,且可抑制金黄色葡萄球菌的生长。综合上述结果,本试验从鸡肠道中分离筛选鉴定出5株耐Cd乳酸菌,包括1株约氏乳杆菌和4株卷曲乳杆菌,在pH接近中性的条件下,对Cd的吸附率可达30%。     

菜籽饼脱毒菌株的筛选

<正>我国是世界油菜生产大国,油菜种植面积和油菜籽产量均居世界第一位,因而菜籽饼资源较为丰富。菜籽饼营养价值很高,据报道,菜籽饼含粗蛋白35.0%～45.0%、粗脂肪2.0%～3.0%、碳水化合物24.0%～32.0%、纤维素8.1%～9.0%、灰分4.5%～5.2%,是一种优良的植物蛋白饲料资源(吴世林,1992)。但菜籽饼中的硫甙等有毒物质和抗营养成分限制了它在饲料、食品工业中的应用。     

绵羊瘤胃内纤维降解菌的分离鉴定

试验从蒙古绵羊瘤胃中分离出3株厌氧细菌,通过细菌纤维降解性试验发现3株菌皆具有纤维降解能力;通过革兰氏染色试验发现3株菌均为革兰氏阳性菌;通过生理生化试验和16S rDNA基因序列测定及同源性分析,最终确定分离的3株菌分别为牛链球菌（Streptococcus bovis）、婴儿链球菌（Streptococcus infantarius）和粪肠球菌（Enterococcus faecium）,编号为E1、E2和E3。