马流感病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上马流感病毒H3N8 HA和NA的基因序列,设计并合成了扩增HA和NA基因RT-PCR引物及NA基因荧光定量RT-PCR引物探针,经条件优化,建立的HA和NA RT-PCR方法检测下限为10 TCID50;荧光PCR方法检测下限为0.1 TCID50。对H5、H7、H9、H3N1、H3N2、Pi等6种病毒核酸进行扩增,发现具有良好的特异性,显示建立的方法具有高效、快速、特异、灵敏的特点,可用于马流感病毒的检测和监控。     

双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立

为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因序列和N9亚型流感病毒的NA基因序列,设计2对特异性引物,在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR。对H7N9亚型流感病毒核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增HA基因263bp、NA基因520 bp的特异性片段,而对其他常见亚型的流感病毒的RT-PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR方法的检测下限为3 pg的H7N9病毒模板。利用该双重RT-PCR方法对30份临床样品进行H7N9病毒进行检测,与病毒分离方法进行对比,结果显示,两者的符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7N9流感病毒的同时检测和鉴别诊断,为H7N9亚型流感的有效防控提供技术支撑。     

禽流感病毒H5、H9亚型的多重RT-PCR鉴别诊断

根据禽流感病毒H5、H9亚型的HA基因序列,设计了两对RT-PCR引物,同时对H5、H9亚型进行了多重RT-PCR扩增,得到了两条清晰的目的带.将目的带回收并进行测序,同源性比较结果证明其为禽流感H5、H9亚型的HA基因序列,作者对多重RT-PCR进行反应条件优化以及敏感性与特异性测定,证明该方法的敏感性和特异性都比较好.初步应用于30份临床病料,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,可用于禽流感病毒H5、H9亚型的鉴别诊断.     

H7和N9亚型及A型流感病毒多重荧光定量RT-RCR检测方法的建立

为同时检测H7亚型、N9亚型和A型流感病毒,本研究根据流感病毒H7 HA、N9 NA以及M基因序列分别合成3对引物和3种荧光素标记的探针,建立了多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.特异性试验结果显示,仅H7亚型和N9亚型病毒分别在FAM和JOE通道监测到荧光信号,而所有A型参考流感病毒株均可获得Cy5荧光信号,此外其他相关的禽源病毒检测结果均为阴性.同时,以H7N9亚型病毒RNA为模板建立了标准曲线,检测H7 HA、N9 NA以及M基因的R2值均为0.999,最低检出量均为35.4 EID50/mL.批内和批间试验的变异系数均小于1.48％.利用该方法对1 072份临床样品(咽喉和泄殖腔拭子)检测,H7N9亚型和A型流感病毒分别检出7份和23份.该方法可以有助于H7N9亚型和A型流感病毒的快速检测及鉴定.     

H3N8亚型马流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立检测H3N8亚型马流感病毒的RT-LAMP方法,根据H3N8亚型马流感病毒HA基因序列,设计了2对LAMP引物,经过优化反应条件,建立了RT-LAMP检测H3N8亚型马流感病毒方法。结果表明,RT-LAMP方法能够在63℃恒温条件下、75min内实现目的基因片段的大量特异性扩增,通过荧光显色就可直接用肉眼判断结果。对H7N7亚型马流感病毒、马动脉炎病毒、马鼻肺炎病毒的核酸无交叉反应,具有较好的特异性;方法的灵敏度比常规RT-PCR的高10倍;该方法操作简便快速、省时省力,而且灵敏度高、特异性强,对H3N8亚型马流感病毒的检测具有实际的应用价值。     

H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因双重荧光RT-PCR检测方法的建立

H5N8亚型禽流感是传播性极强的人兽共患病,为了简便快速的检测H5N8亚型禽流感病毒,针对H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列分别设计合成特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了同一反应程序下同时扩增HA基因和NA基因的双重荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该检测方法特异性强,不与其他亚型禽流感病毒和禽常见病原发生交叉反应,敏感性可达10copies/μL;组内组间重复性好,平均变异系数均小于0.4%;用该方法对108份临床样品检测,结果与病毒分离鉴定方法检出率一致。综上所述,建立的H5N8亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,为H5N8亚型禽流感的快速诊断和疫情防控提供了一定的技术支持。     

H5N6亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10~(-5),NA基因检测的灵敏度为10~(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。     

焦磷酸测序技术在确证猪甲型H1N1流感病毒中的应用

目的本研究旨在通过对猪甲型H1N1流感病毒进行序列信息分析的基础上,利用焦磷酸测序技术建立一种快速、简单地确证猪甲型H1N1流感病毒的方法。方法通过序列信息比对,设计H1HA和N1NA基因保守区段的扩增引物及测序引物。从感染猪甲型H1N1病毒的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(PSQ)针对HA基因和NA基因进行保守核苷酸区段的测序分析。利用扩增引物与其他猪源病毒进行特异性试验,利用测序引物进行重复性试验。将该方法与病毒分离和荧光定量RT-PCR方法做临床样品的平行检测,并比较结果。结果通过序列信息比对寻找到表征H1N1亚型的核苷酸保守区段,经焦磷酸测序后能进一步确证毒株的序列信息为猪甲型H1N1流感病毒。特异性试验表明,不与其他猪源病毒发生交叉反应;重复性试验表明,重现性为100%。对221份临床样品检测表明,病毒分离鉴定与焦磷酸测序方法结果符合率为96.8%,与TaqMan荧光定量方法检测结果符合率90.3%。经统计学分析,焦磷酸测序确证与病毒分离鉴定在检测临床样品上,两者差异不显著。结论基于序列分析的焦磷酸测序技术可以作为进一步确证方法使用。     

H5N1禽流感病毒微磁粒捕捉系统和SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用禽流感H1N1抗体包被微磁珠制备免疫磁珠,再通过抗原抗体反应得到了含有N1亚型的病毒,然后设计针对H5亚型的特异性引物,同时构建含有H5亚型HA基因部分序列的标准质粒,定量后作为模板,建立了可以检测H5亚型禽流感病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果表明,制备的免疫磁珠可以吸附4个血凝单位的H5N1流感病毒和5个血凝单位的H1N1流感病毒,而对H9N2亚型流感病毒无特异性结合,从而可以富集N1亚型的流感病毒.H5亚型RRT-PCR检测灵敏度可达到4.6拷贝/μL,线性范围达5个数量级;特异性强,与NDV和H1、H9亚型禽流感病毒不发生交叉反应.因此,利用该方法可以很好地检测H5N1禽流感病毒.     

猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果,该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性,而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/μL。对37份现地病料的检测结果也表明该法(检出17份)比常规RT-PCR方法(检出12份)和TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法,检出10份)的敏感性高。     

H4、N2和所有亚型禽流感三重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测H4、N2和所有亚型禽流感的方法,分别针对H4亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因保守序列,设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,对三重反应体系进行特异性和敏感性验证,建立了H4、N2和所有亚型AIV三重RT-PCR检测方法,并用该法对临床样品进行检测。建立的方法能特异性扩增H4、N2和所有亚型AIV,与其他禽病病原体不发生交叉反应;对H4、N2和所有亚型AIV至少能检测到6 pg/μL。在185份临床样品的检测中,检出4份H4、10份N2和19份AIV阳性。所建立的三重RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,为快速检测H4、N2和所有亚型AIV提供了有效的方法。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5′非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR方法。试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著。与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×102病毒基因组拷贝数。利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交叉免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。     

猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型 RT-PCR方法的建立

根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出10⁴ EID₅₀病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出10⁴ EID₅₀病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用简

据猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）S基因序列设计1对特异性引物,通过对实时荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法,同时对12份病料进行检测,并与常规RT-PCR进行比较。结果显示,该方法的敏感性达到43.07拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性,而常规RT-PCR最低只检测到4.307×10³ 拷贝/μL,敏感性较低。本试验建立的检测TGEV S基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法为传染性胃肠炎的鉴别诊断及TGEV的分离鉴定奠定了技术基础。     

5种外来病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

通过GenBank中对小反刍兽疫病毒N蛋白基因、亨德拉病毒及尼帕病毒H蛋白基因、西尼罗河热病毒PrM蛋白基因和非洲猪瘟病毒P72基因这5种外来病病毒的主要基因的分析比较,选择相应基因的保守序列进行人工合成,并对每段基因设计2对引物,扩增片段大小均在350-550bp之间。通过对条件的反复优化,建立了1种能够同时检测到这5种病原的并联PCR/RT-PCR方法。结果显示,该方法最低可检测到10-5 mg/L的病毒的DNA/cDNA,而且特异性强、重复性好。在45份猪样品及56份蝙蝠样品的检测中,只有阳性对照出现了目的条带,而其他均未出现目的条带。这说明本研究建立的5种主要外来病病毒并联PCR/RT-PCR的检测方法具有灵敏度高、特异性好的特点,可用于ASFV、PPRV、HeV、NiV和WNV的预防、检测及扑灭。     

Development and Application of One-step Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR Assay for Rapid Detection of H1 Subtype Swine Influenza Virus

To establish a rapid, simple and accurate method to diagnose and detect H1 subtype swine influenza virus (SIV), the specific primers and TaqMan MGB probe were designed according to the conserved region of HA gene of H1 subtype SIV. A one-step Real-time fluorescent quantitative RT-PCR assay was developed for detection of H1 subtype SIV. A series of dilutions of recombinant plasmids pMD18-H1 were prepared and used to generate standard curves. The results showed that the one-step Real-time fluorescent quantitative RT-PCR was capable of detecting 10² copies of H1 subtype SIV per microliter. The results were negative for the detection of H3N2 and H9N1 subtypes SIV, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine epidemic diarrhea virus, transmissible gastroenteritis virus. The coincidence rates between one-step Real-time fluorescent quantitative RT-PCR and virus isolation were 94%. The method was highly specific and sensitive, and could be used for rapid quantitative detection of H1 subtype SIV.     

双重RT-PCR同时快速检测H5亚型禽流感病毒和新城疫病毒强毒株

本研究针对AIV H5的血凝素(HA)基因和vNDV的融合蛋白(F)基因设计两对引物,建立了单管同时检测AIVH5和vNDV的双重RT-PCR(dRT-PCR),该方法能在单一反应管内同时检测AIVH5和vNDV,不与其它亚型AIV、弱毒NDV毒株以及其它病原体发生非特异性扩增;对含有AIV H5 HA基因和vNDV F基因重组质粒DNA的最低检测限分别为20.6和406fg,敏感性与单项RT-PCR相同;从样本处理到报告结果仅需5h。对24份临床疑似样本进行检测,AIVH5均为阴性,vNDV阳性18份,PCR产物测序证明为靶基因序列,其具有vNDV F基因的特征性序列,随机选9份vNDV阳性样本接种SPF鸡胚,分离出6株vNDV,病毒分离率为6/9;对100 ELD50的AIV H5N1和100 ELD50的vNDV人工同时感染5日龄SPF鸡的脑、肝脏、肺脏和泄殖腔棉拭子进行dRT-PCR检测,AIV H5的检测率为4/5,3/5,5/5,4/5,vNDV的检测率为3/5,5/5,4/5,3/5,而对H9N2和LaSota毒株实验同时感染样本及阴性对照样本的检测均为阴性。可见本研究建立的dRT-PCR为AIV H5和vNDV诊断、监测、检疫及分子流行病学调查提供了特异性强、操作简单、检测速度快、成本低廉的新方法。     

H3亚型猪流感病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快捷、可行的检测H3亚型猪流感病毒(SIV)的方法,本研究根据GenBank中登录的H3亚型SIV HA基因的保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了一种检测H3亚型SIV的SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法,并进行灵敏度、稳定性和特异性试验,与普通PCR进行比较.研究结果表明,标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,R2为0.994,CV在0.17％～1.41％之间,具有良好稳定性.除H3亚型SIV外,对H1、H4、H6、H9亚型SIV以及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒和猪圆环病毒2型的检测均为阴性,与普通PCR相比更灵敏.该方法特异性好,准确率高,适于临床分离鉴别H3亚型SIV.     

基因Ⅶ型新城疫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋白基因保守序列设计并合成特异性引物,建立快速检测Ⅶ型新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列,并将其连入T-Easy载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999。检测结果显示,该方法的灵敏度可达100 copies/μL,而且特异性良好,除Ⅶ型新城疫病毒外,对Ⅱ型/Ⅲ型/IV型/Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究所建立的检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。对40份实验感染样品的检测结果表明,其检出率为95%,而常规RT-PCR方法检出率仅为70%,表明该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强。