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相似文献
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1.
为了体外评价靶向高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV) ORF7的siRNA对HP-PRRSV复制的抑制效果。将3μg siRNA重组质粒载体pSilencer-N2转染于Marc-145细胞中,24 h后再分别接种0. 01 MOI PRRSV,感染病毒48 h后,观察其抑制HP-PRRSV HN1株复制效果;待细胞感染病毒72 h后,应用间接免疫荧光试验(IFA)、实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA重组质粒对HP-PRRSV在细胞中复制的抑制作用。体外结果显示,在最佳接毒量0. 01 MOI和最佳接毒时间24 h时,siRNA重组表达质粒在HP-PRRSV感染后48 h能明显抑制病毒的复制,与对照组相比,病毒滴度降低了2个多数量级,抑制达到100~1 000倍。有效干扰持续时间,检测结果表明,与对照组相比,siRNA重组质粒显著抑制HP-PRRSV的增殖,推迟CPE的发生时间,其抑制作用可以持续到感染后的4天。为高致病性猪繁殖与呼吸综合征防控提供有力的物质支持。  相似文献   

2.
以pUTA2LacZ为真核表达载体,以中国流行株O型口蹄疫病毒(FMDV)NY00株结构蛋白前体P1基因、猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白和复制蛋白基因为目的基因,构建了2个重组质粒作为中间转移质粒,标记为pUTALP1-ORF2和pUTALP1-ORF20RF1.将这2个重组转移质粒分别酶切鉴定后,与鸡痘病毒野毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞.结果显示,重组核酸质粒构建正确,并能进行表达.经5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)加压筛选,挑取单个蚀斑,3次纯化,获得2株重组毒vpUTALP1-ORF20RF1和vpUTALP1-ORF2.结果表明,这2株重组鸡痘毒在电镜下可形成完整的病毒粒子.  相似文献   

3.
从质粒pMT-E1a和pIRES-neo中获得目的基因E1a和PolyA并连接入质粒pKS-hTERTp,用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后连接入线性化的pAd-Apoptin,获得穿梭载体pAd-apoptin-PolyA-hTERTp-E1a。穿梭载体pAd-ApoptinPolyA-hTERTp-E1a和腺病毒骨架质粒(pAd5)共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a,采用RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,MTS法检测病毒对A549细胞的抑制作用;绘制重组腺病毒生长曲线,监测重组腺病毒在细胞内的复制能力。结果显示:构建出的重组腺病毒中包含有了目的基因Apoptin和E1a,并且目的基因在细胞中正确的表达;MTS结果显示重组腺病毒对A549具有抑制作用,且抑制作用具有一定的时效及剂效关系;重组腺病毒具有在A549细胞中正常复制的能力。结果表明:成功的构建出了具有特异性杀伤和特异性复制能力的双重特异性重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a。  相似文献   

4.
探究RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对口蹄疫病毒复制的抑制作用,本研究选取O型口蹄疫病毒ON株,以ON株口蹄疫病毒3C、3D、VP1蛋白基因作为靶基因。对每一个靶基因设计并合成两对小片段发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)引物,分别命名为VP1-1、VP1-2、3C-1、3C-2、3D-1、3D-2,依据RNAi的原理构建6个shRNA的重组表达质粒,转染BHK21细胞后并接种ON口蹄疫病毒,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测筛选出能高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒;将能够高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒进行慢病毒的制备并筛选稳定的BHK21细胞系,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测慢病毒干扰载体对ON口蹄疫病毒复制的抑制作用。结果显示,构建的6个shRNA重组表达质粒抑制率均在71.5%~93.2%,其中PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效果最为明显,分别为93.2%和90.8%;慢病毒干扰载体PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效率在88.3%~95.49%。对研究结果表明,在细胞的水平上挑选出有效抑制ON口蹄疫病毒复制的基因干扰片段,并成功制备慢病毒干扰载体,为后续抗口蹄疫病毒的转基因羊生产培育奠定了实验基础。  相似文献   

5.
为探索猪血小板反应蛋白3(thrombospondin 3,THBS3)在PRV复制中的功能,利用CRISPR/Cas9系统构建THBS3基因缺失的PK-15稳定细胞株。首先,根据THBS3基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则设计并合成2对sgRNA序列,退火后连接到Lenti-CRISPRv2慢病毒表达载体;与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(HEK293T)获得重组慢病毒,收集细胞上清并离心去细胞碎片后转导PK-15细胞,进行嘌呤霉素筛选获得THBS3敲除的PK-15细胞株;将重组病毒rPRV-GFP接种至野生型和缺失型细胞评价病毒复制差异。结果显示,表达sgRNA的重组质粒构建成功;将收获的慢病毒转导细胞后通过筛选获得1株无THBS3蛋白表达细胞株(PK-THBS3-KO),通过测序发现外显子3有1个碱基的插入;感染试验显示,THBS3基因缺失后抑制了PRV复制。结果表明,通过CRISPR/Cas9系统成功构建了PK-15的THBS3基因敲除的稳定细胞株,PRV感染试验显示基因缺失后抑制了病毒复制。  相似文献   

6.
为了利用多分子伴侣表达载体在大肠埃希氏菌中融合表达人干扰素(IFNα)-2b,并进行IFNα-2b纯化工艺研究,试验采用人工设计并合成Smt3-IFNα-2b克隆至自行构建的P32-TrxA载体中,将重组表达质粒P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b转化至大肠埃希氏菌(E.coil)BL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析,在此基础上利用金属螯合层析、SUMO蛋白酶酶切、阴离子交换层析以及凝胶层析建立了IFNα-2b的纯化工艺。结果表明:重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;融合蛋白分子质量约为40 ku,主要以可溶形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上;纯化的IFNα-2b分子质量约为17 ku,蛋白纯度达到95%以上,利用细胞病变抑制法测得干扰素的效价为1.0×10~8IU/mg。说明成功在大肠埃希氏菌中表达并经过简易工艺纯化了重组蛋白IFNα-2b。  相似文献   

7.
以含有猪流感病毒A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)NP基因的重组质粒pMD18-NP为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增NP基因,将其亚克隆至质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有NP及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-NP-EGFP。利用脂质体转染法将穿梭质粒pDC315-NP-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选到重组腺病毒rAd-NP-EGFP。经PCR和Western blotting鉴定,结果表明NP基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物学活性。重组腺病毒rAd-NP-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.26×1010/mL,为进一步研究该重组病毒的免疫原性奠定了基础。  相似文献   

8.
为研制具有较强细胞免疫作用的单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)疫苗,将HSV-2糖蛋白D(gD)序列与糖蛋白B(gB)上两种CTL表位序列连接,人工合成重组基因gD-gBCTL,通过PCR扩增,将其克隆后连接至原核表达栽体pET-22b(+),构建重组基因表达质粒pET-22b(+)-gD-gBCTL,转化E.coli B...  相似文献   

9.
应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E0,PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中,用Western blot检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒免疫小鼠和猪,结果2次免疫后产生明显的免疫应答,ELISA检测小鼠血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10240;猪血清抗体滴度分别为1∶16和1∶64。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒,该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度,免疫猪后能提供一定的保护效果。  相似文献   

10.
为研究马属动物SAMHD1的抗病毒活性,本研究构建了稳定表达马SAMHD1(eqSAMHD1)、驴SAMHD1(doSAMHD1)的U937细胞系。利用pLPCX慢病毒表达载体构建重组质粒pLPCX-doSAMHD1-HA和pLPCX-eqSAMHD1-HA。将重组质粒和假病毒包装重组质粒(pCgp和pVSV-G)共转染于293T细胞中,制备表达SAMHD1的假病毒,将其感染人急性单核细胞白血病细胞系U937,利用嘌呤霉素筛选,建立了稳定表达doSAMHD1和eqSAMHD1的U937细胞系。经western blot鉴定,该细胞系能够稳定表达doSAMHD1和eqSAMHD1蛋白。将人类免疫缺陷病毒(HIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)的假病毒感染该细胞系,结果显示表达eqSAMHD1和doSAMHD1的细胞系均能够显著抑制HIV假病毒复制,限制倍数分别为17~19倍和14~18倍;两种细胞系也能够抑制EIAV假病毒复制,限制倍数分别为3~4倍和2~3倍。该细胞系的建立为进一步评价和研究马属动物SAMHD1的抗病毒机制奠定了基础。  相似文献   

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