家鸡CHD1基因PCR快速性别鉴定方法的建立及其在早期鸡胚中的应用

本试验以优化PCR条件,建立快速性别鉴定方法为目的,从家鸡雏鸡血样、鸡胚羊水和尿囊液中获得DNA进行性别鉴定.通过对家鸡的两个性别鉴定候选基因CHD1和xho Ⅰ重复片段进行PCR扩增引物筛选和反应体系的优化.结果显示CHD1基因PCR法可稳定、准确地用于鉴定家鸡性别,该体系经改进和优化后,缩短了鉴定时间,提高了鉴定的稳定性和准确性.在此基础上利用12.5日龄鸡胚羊水和尿囊液建立了早期胚胎的性别鉴定体系.该方法为家鸡早期胚胎性别鉴定批量化的快速操作提供了可行的依据,同时也为鸟类性别决定机制的研究奠定了基础.     

采用血液、羽毛等材料鉴别鸡性别PCR方法的应用研究

公母鸡染色体上的染色体螺旋蛋白基因(chromobox-he-licase-DNA binding gene,CHD 1基因)的内含子基因序列存在差异,通过PCR方法可扩增该基因内含子的保守序列,可对鸡等非平胸禽类的性别进行鉴定。本研究首先采集42只28日龄肉鸡抗凝血,完成血液DNA PCR鉴定性别,结果表明,42只商品肉鸡中22只公鸡、20只母鸡,与剖检结果相同;其次,采集20只90日龄SPF鸡(13只公鸡、7只母鸡)和15只2日龄SPF鸡的抗凝血和羽毛,完成其DNA的PCR鉴定以及与微量血的PCR检测结果的比较。结果表明,90日龄、2日龄SPF鸡的微量血PCR与抗凝血、羽毛提取DNA的PCR鉴定结果均相同,其中,90日龄SPF鸡与其外观性别完全吻合;另外,采集12枚15日龄鸡胚的尿囊液、羽毛、肌肉,提取DNA后PCR方法可扩增出区分性别的特异性条带,鉴定结果一致,12枚15日龄鸡胚中均为7个雄性、5个雌性。本研究表明,微量血PCR和血液、羽毛等材料提取DNA后的PCR方法均可准确快速鉴定鸡和鸡胚的性别,可作为家禽育种过程中常规鉴定方法的有力补充,适合大型养殖场规模化鉴定,也满足科研领域区分鸡和鸡胚性别的需求。     

影响牛PCR胚胎性别鉴定反应率的因素分析

本研究对影响牛PCR胚胎性别鉴定反应率的因素进行了分析，以提高胚胎性别鉴定效率。结果表明取样时样品中加入透明带残片使PCR反应率显著降低；取样大于等于5个细胞组PCR反应率显著高于取样1～4个细胞组；取样为死细胞和散细胞组的反应率略高于取样为活细胞组，但二者无显著差异；胚胎质量对反应率无显著影响；桑椹胚和早期囊胚的反应率显著低于囊胚和扩张囊胚，囊胚和扩张囊胚间差异不显著。     

微量全血PCR技术鉴定雏鸡及鸡胚性别

为了便于常规PCR技术在鸡性别鉴定上的推广和应用,本研究以成年家鸡全血为模板,应用常规PCR反应缓冲液和Tap DNA聚合酶直接进行PCR扩增,对50 μL PCR反应体系中的血样(0.05~4.0 μL)和Tap DNA聚合酶的使用量(0.05~1.5 μL),以及循环次数(30~40)进行了优化,在此基础上对血样的抗凝剂和保存温度进行了探讨,并对62只1日龄雏鸡、80枚12日龄和80枚16日龄鸡胚的血样直接PCR进行了性别鉴定。结果表明,采集血样时可以使用ACD、肝素或EDTA作为抗凝剂,血样可以在4、－20或－80 ℃至少保存3个月;使用0.1 μL全血就能完成雏鸡和鸡胚性别鉴定,全血PCR鉴定性别与性腺性别的符合度为100%。与常规PCR相比,全血PCR节约了检测成本,提高了检测效率,减少了交叉污染可能。     

昆明小鼠不同性别早期胚胎体外培养发育潜力观察

自主设计2对引物,提取已知性别小鼠肝细胞DNA,扩增雄性小鼠特有的Sry基因及雌、雄小鼠共有的ZFX基因,建立双重PCR性别鉴定方法.提取小鼠早期8细胞胚胎单卵裂球、双卵裂球DNA,分别进行双重PCR性别鉴定,选择出早期8细胞胚胎的适宜模板量;将已测性别的8细胞胚胎按照雌、雄性别分开培养,观察统计雌、雄8细胞胚胎发育至囊胚的比率.试验结果显示,与单个卵裂球DNA模板量相比,双卵裂球的模板量检出率高,两者之间差异显著(75.00%Vs 93.33%,P<0.05);经过性别鉴定的雄性8细胞胚胎比雌性8细胞胚胎发育至囊胚的比率高,两者之间差异显著(53.33%Vs 33.33%,P<0.05).结果表明,采用双重PCR性别鉴定方法,以双卵裂球的DNA量为模板能够有效的对小鼠早期8细胞胚胎进行性别鉴定;雄性胚胎在体外培养条件下比雌性胚胎具有更好的发育潜力.     

兔早期胚胎PCR性别鉴定体系的建立

根据兔SRY基因序列设计两对引物作为兔雄性特异性引物,根据兔APP基因序列设计1对引物作为内标引物,分别建立了兔早期胚胎性别鉴定的双重PCR和巢式PCR反应体系,在不同浓度的基因组DNA和兔早期胚胎上进行性别鉴定应用,同时,对兔SRY巢式PCR引物特异性进行了分析。结果表明,多重PCR扩增兔基因组DNA可以准确判定其性别,扩增灵敏度为100pg基因组DNA;多重PCR鉴定24枚兔32细胞桑椹胚性别,只能对整胚成功鉴定。巢式PCR,公兔基因组DNA扩增出282bp的SRY基因片段,母兔没有扩增产物,扩增灵敏度为10pg;对24枚兔32细胞桑椹胚性别鉴定结果表明,巢式PCR可以对少至4个胚胎细胞进行准确鉴定,同一胚胎结果符合率为100%(24/24)。SRY引物只对兔雄性基因组DNA特异,而其他动物(人、牛、绵羊、小鼠)雄性DNA及兔的冲卵液,均无PCR产物。     

脂质体转染胚盘细胞将外源质粒pEGFP-C2导入鹌鹑胚的研究

运用脂质体转染第Ⅹ期胚盘细胞的方法将外源质粒pEGFP C2经脂质体包裹后注射到鹌鹑种蛋Ⅹ期胚盘下腔,孵化种蛋.提取孵化6d的鹌鹑胚基因组DNA,进行PCR检测,嵌合体阳性率为84％,证实外源基因在胚胎中的表达.对孵化至出壳的G0代鹌鹑组织进行DNA提取并PCR分析,以及组织切片荧光检测,证实外源基因在G0代鹌鹑组织中成功表达.结果表明脂质体转染胚盘细胞是一种制备转基因鹌鹑行之有效的方法.     

不同PCR法对牛性别鉴定的影响研究

为建立一种有效的牛早期胚胎PCR性别鉴定方法,试验以12头已知性别的牛全血为试验材料,提取基因组DNA,分别运用常规PCR法、多重PCR法和巢式PCR法进行牛性别鉴定研究,用2对SRY(Y染色体性别决定区)引物和1对牛特异性引物扩增牛核基因组DNA进行牛性别鉴定,建立3种牛性别鉴定的PCR反应体系。结果表明,3种方法准确率均为100%,其中巢式PCR法检测灵敏度可达13pg,多重PCR法整个鉴定过程约需3h。     

超微量DNA模板扩增鉴定绵羊早期胚胎性别体系优化

本实验旨在运用超微量胚胎DNA模板扩增SRY基因鉴定绵羊早期胚胎性别PCR体系和方法优化.根据绵羊Y染色体性别决定SRY基因的723 bp的保守序列设计引物,析因法建立巢式PCR体系,联合扩增SRY和GAPDH基因,经绵羊静脉血液和胚胎超微量DNA样本调整测试灵敏度后,切割40枚绵羊桑椹胚的少量胚细胞进行性别鉴定,并对...     

PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

早期胚胎性别鉴定的方法有很多种,大致可分为两大类：一是前期主要采用的非生物学方法,如组织方法,免疫学方法[~[p16]〔1〕],X-相关酶法[~[p16]〔2〕]等,这些方法都缺少准确性和速度;二是80年代末,随着DNA体 外重组技术而发展起来的分子生物学方法,如DNA探针法〔3〕,聚合酶链反应法（PCR）。其中PCR法以灵敏、特异、准确和快速等特点,而成为胚? 胎性别鉴定中最有研究价值的技术方法。自Herr等（1990）[~[p16]〔4〕]报道了用PCR进行奶牛胚胎性别鉴定技术之后,国内外许多学者从事了这方面的研究 ,使准确率接近或达到了[=]100%,同时操作过程也简化了许多,并且可以在几个小时内完成,为PCR法进行早期胚胎性别鉴定应用于生产提供了基础。