鲤鱼肠道中沙门氏菌、志贺氏菌分离鉴定及药敏试验

从江苏省某市菜市场采集商品规格(体重0.5~0.6 kg)的鲤鱼(Cyprinus carpio),利用SS选择培养基分离纯化获得107株肠道细菌,对其中2个典型菌株(编号CS-1、CS-2)进行细菌形态学观察、生化试验及药敏试验等研究。结果表明,CS-1、CS-2菌株均为革兰氏阴性小杆菌,均能利用葡萄糖产气,MR试验阳性、氧化酶和VP试验阴性;其中CS-1菌株吲哚产生阴性,硫化氢、半固体试验阳性;CS-2菌株则相反,初步鉴定CS-1为沙门氏菌,CS-2为志贺氏菌。药敏试验结果显示,CS-1、CS-2两菌株对先锋必素、先锋霉素Ⅳ、头孢孟多、头孢噻吩、呋喃妥因、氧哌嗪青霉素等药物高度敏感;对氯洁霉素、洁霉素、灭滴灵、利福平、红霉素等药物不敏感。该研究对水产品食品安全检疫及鱼类疾病防治等具有重要参考价值。     

致麻鸭输卵管炎的鸭疫里默氏菌的分离鉴定及致病性观察

从湖北天门某鸭场送检的具有明显输卵管炎的疑似鸭疫里默氏菌病死鸭的脑中分离出3株细菌。经细菌形态学鉴定、培养特性、生化试验、血清型鉴定、细菌16S r RNA的PCR鉴定及动物回归试验证明该3株菌为血清型1型的鸭疫里默氏菌,其致病性强,并分别命名为TM-R1,TM-R2,TM-R3。该3株菌对先锋霉素,美满霉素,氧哌嗪青霉素等高度敏感;对氯洁霉素、多粘霉素B、麦迪霉素、卡那霉素耐药;TM-R2、TM-R3对红霉素耐药;而TM-R1对红霉素中度敏感。     

罗非鱼肠道中弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定

为了对罗非鱼肠道中弗氏柠檬酸杆菌进行细菌形态学观察、生化试验及药敏试验等研究,试验从罗非鱼肠道中分离、纯化获得2株典型细菌,分别编号为LF-1和LF-2。结果表明:2株细菌均为革兰阴性短杆菌,可以利用枸橼酸盐、葡萄糖产气,其中LF-1鸟氨酸脱羧酶为阴性,而LF-2鸟氨酸脱羧酶为阳性,查询数值编码表确定为弗氏柠檬酸杆菌。药敏试验结果显示,2株细菌均对氯霉素、庆大霉素、头孢孟多、奥复星、诺氟沙星等药物高度敏感。     

健康羚牛肠道芽孢杆菌的分离与鉴定

为了研究羚牛肠道微生态环境,试验对健康羚牛新鲜粪便进行了细菌培养和鉴定。结果表明:共分离出3株革兰阳性长杆菌,均具有芽孢;其中2株菌为兼性厌氧菌,1株为需氧菌,都可在pH值为5.7的培养基和7%NaCl培养基中生长,但对糖和盐的利用具有特殊性;通过细菌形态观察和生化试验最终确定这3株菌依次为苛求芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和栗褐芽孢杆菌。     

志贺氏菌属环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测志贺氏菌属的方法,本研究针对其ipaH基因,建立了志贺氏菌属环介导恒温护增(LAMP)快速检测方法。利用该方法对50株细菌进行检测,结果显示7株志贺氏菌均为阳性,其它菌均为阴性,表明该方法具有高度特异性。灵敏度试验显示,对志贺氏菌纯培养菌的检测灵敏度为28cfu/mL,对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为35cfu/mL。利用该方法对195份涉及肉类、奶类、豆制品及人工污染样品进行检测,共检出29份阳性样品,与细菌分离鉴定检测结果一致。该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。     

西宁市售鲤鱼鳃中志贺氏菌的检测及血清学分型

志贺氏菌是最常见的肠杆菌科的病原菌,可引起人类肠道传染病。应用常规细菌分离法对西宁市售的80份鲤鱼鳃样品进行了志贺氏菌的检测,同时对阳性菌株进行了血清学分型。结果显示,在80份鲤鱼鳃样品中共检出志贺氏阳性6份,阳性率为7.5%(6/80)。通过形态学观察、生化试验和血清学鉴定为志贺氏菌A群2株,其血清型为痢疾志贺氏菌1型;B群4株,其血清型为福氏志贺氏菌1b型。此次检测为以后西宁地区志贺氏菌流行病学的调查和相关疾病的防治提供了理论依据。     

鸭疫里默氏杆菌的鉴定及药敏试验

从四川某鸭场送检的病料中分离到1株疑似鸭疫里默氏杆菌(Riemeralla anatipestifer,RA)。经细菌形态学、培养特性、生化试验、PCR扩增与动物回归试验鉴定后,证实为鸭疫里默氏杆菌。该菌尿素酶试验阳性,不能发酵多种糖类,不能液化明胶,不产生H2S,不还原硝酸盐,吲哚试验、MR试验、VP试验均为阴性;菌株对左氟沙星、氧哌嗪青霉素、庆大霉素等极为敏感,而对青霉素、头孢拉定、链霉素等耐药。     

台湾泥鳅死亡致病菌的分离鉴定及药敏试验

为确定捕捞转场后造成台湾泥鳅（Paramisgurnus dabryanus ssp.Taiwan）死亡的病原,本试验对台湾泥鳅进行病理解剖、病原分离。对分离菌进行形态学观察、生理生化特性测定及16S rDNA基因测序鉴定,并进行人工感染试验、药敏试验。结果显示,从泥鳅肝脏、脾脏、肾脏及肠道组织中分离到形态一致的优势菌株,经纯化保存,命名为XJC。菌株XJC葡萄糖发酵、D-葡萄糖、鸟氨酸、苯丙氨酸及尿素利用阳性,其他所测生化指标均为阴性,与摩氏摩根菌（Morganella morganii）一致;16S rDNA基因序列与摩氏摩根菌相似性达99.6%,被鉴定为摩氏摩根菌。感染试验结果表明,菌株XJC对台湾泥鳅具有致病性,被感染的泥鳅出现了肠道充血典型病理变化。从发病泥鳅体内分离到与菌株XJC一致的菌株,可以判定菌株XJC是泥鳅病原菌。药敏试验结果表明,菌株XJC对氨基糖苷类、喹诺酮类及第三代头孢类药物表现出敏感,对四环素、青霉素、红霉素、多肽类、呋喃唑酮、洁霉素及第一、第二代头孢类药物均等表现耐药,生产中可选用氨基糖苷类、喹诺酮类药物进行摩氏摩根菌疾病的防治。本试验结果可为台湾泥鳅摩氏摩根菌病诊断和防治提供参考。     

白鹭大肠埃希菌的分离鉴定与药敏试验

对3份白鹭新鲜粪便进行细菌分离纯化、染色镜检和生化鉴定,并用Kirby-Bauer法对分离细菌用30种抗菌药进行了耐药性试验。结果表明,分离到3株革兰阴性小杆菌为大肠埃希菌,分别编号为E1、E2和E3。3株白鹭大肠埃希菌都对青霉素G、阿莫西林、万古霉素和洁霉素耐药,对常用广谱抗菌药物有2重以上耐药性,但对试验用的氨基苷类抗生素、喹诺酮类药物和复方新诺明高度敏感。     

致病性产H2S大肠杆菌和产气肠杆菌的分离与鉴定

为了研究某规模化猪场胀气死亡母猪的病原及筛选有效治疗药物,试验采用常规细菌分离培养方法,对其消化道进行致病菌分离、鉴定、动物攻毒试验和药敏试验。结果表明:从肠道内分离出2株细菌纯培养物,均为革兰阴性短杆菌,一株菌为H2S阳性大肠杆菌,另一株菌为产气肠杆菌;2株分离菌均可致死小白鼠。H2S阳性大肠杆菌对新霉素、新生霉素和痢特灵高度敏感,对哌拉西林和阿米卡星中度敏感,对其他药物低敏或不敏感;产气肠杆菌对阿米卡星高度敏感,对哌拉西林、链霉素、阿莫西林、新生霉素、痢特灵和强力霉素中度敏感,对其他药物低敏或不敏感。     

猪致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

从湖北省襄樊地区7家猪场采集病料进行大肠杆菌分离培养,获得36株菌株。通过菌落和细菌形态学观察、生化试验和动物试验确定分离细菌为致病性大肠杆菌。应用纸片扩散法对分离的大肠杆菌进行药物敏感试验,结果表明,对丁胺卡那霉素敏感的菌株有81％,氟苯尼考42％,庆大霉素39％,痢菌净33％,新霉素31％。对阿莫西林耐药的菌株为86％,氯霉素72％,土霉素56％,卡那霉素47％、庆大霉素47％。通过本次试验可知丁胺卡那霉素可作为襄樊地区防治致病性大肠杆菌的首选药物,氟苯尼考作为备选药物。     

5株堆形艾美耳球虫线粒体cox3基因的扩增及序列分析

以5株堆形艾美耳球虫为研究对象,对其线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅲ亚基(cox3)的部分基因(pcox3)进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的顶复门原虫相关序列进行比较,研究其线粒体cox3基因遗传变异情况。结果每个虫株均获得572bp的目的片段,利用DNAStar软件进行序列比对,5株堆形艾美耳球虫线粒体pcox3序列完全一致,与疟原虫和住白细胞虫相应序列的相似性分别为51%和50%,而与泰勒虫的相似性少于50%。本研究首次报道了堆形艾美耳球虫pcox3序列,结果显示不同来源的堆形艾美耳球虫pcox3序列没有差异,与毒力无关,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。     

五指山猪与长白猪65 d胎儿组织MRFs家族基因的表达研究

 
以五指山猪和长白猪妊娠65 d胎儿腿部骨骼肌、背部骨骼肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、胃、脑10种组织为材料,采用qPCR技术,检测和研究MRFs基因家族成员（包括MyoD1、Myf4、Myf5和Mfy6基因）在以上10种组织中的mRNA表达水平及差异。结果表明：（1）MRFs家族成员除肝、肾、肠组织以外,在五指山猪65 d猪胎儿组织中mRNA表达水平均高于长白猪相应组织中的表达水平（P<0.05）;（2）MRFs家族成员表达水平在腿肌和背肌中的表达普遍偏高,其他组织中表达较低（P<0.05）;（3）2个猪种在以上10种组织中MRFs家族mRNA表达水平的高低分布基本一致,其相对表达量顺序为：腿部骨骼肌＞背部骨骼肌＞肝＞肺＞胃＞脾＞脑＞肾＞肠＞心。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒VP1基因片段的克隆与表达载体的构建

为研究鸭肝炎病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达情况,根据鸭肝炎病毒核苷酸序列设计1对外引物和1对含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的内引物。以内外引物进行PCR扩增,将所得PCR产物回收,以相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET-32a后构建重组表达载体,并转入宿主菌BL21和Rosseta,经酶切、PCR和测序鉴定,证明VP1基因正确插入了表达载体。用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,结果表明,VP1基因片段在大肠杆菌Rosseta和BL21中均难以表达。     

牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用

根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列，设计合成了3对引物，以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板，通过优化反应条件，建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带，羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带，该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg，对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测，虎红平板凝集试验作对照，结果PCR检测9份为阳性，且全为牛种布鲁菌阳性，对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明，建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性，为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD07b株的分离鉴定及Nsp2基因同源性分析

在某集约化猪场采集疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病死猪的肺、淋巴结等病料，进行检测，将RT-PCR检测结果为阳性的病料处理后接种Marc-145细胞，培养72～96 h后细胞单层出现明显的CPE。收获病毒经RT-PCR方法检测，并将此PCR产物经纯化后连同引物送相关公司进行测序，结果显示，该病毒为繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因缺失株，将该病毒命名为HPPRRSV-GD07b株。将GD07b株序列与国内外19株PRRSV Nsp2基因进行比较分析，结果表明，该毒株Nsp2基因与CH-1a株等4株PRRSV经典株同源性较低，为60.5%～81.6%；而与14株变异株同源性较高，为90.6%～98.9%。     

淡水鱼虾华支睾吸虫囊蚴感染情况调查

采集吉林省白城地区镇赉县周边6个鱼塘的各种鱼类,用直接压片镜检法和人工消化法分别对采集回来的麦穗鱼感染华支睾吸虫囊蚴的情况进行统计调查,结果表明,感染率最高、感染强度最大的鱼塘是四方坨六分场。随即对四方坨六分场鱼塘中各种鱼类华支睾吸虫囊蚴感染情况也采用同样方法进行调查,结果显示,感染率最高的是麦穗鱼、银飘鱼、尖头鱥,均为100%;其次是细鳞鱼,为80%;其他种类的鱼虾均未检测到有华支睾吸虫囊蚴寄生。     

3种瘤胃纤维分解菌实时定量PCR方法的建立

为探索以减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫对宿主动物胃肠道微生态的影响，本试验以白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌3种主要瘤胃纤维分解菌16S rRNA分别设计引物，以山羊瘤胃液提取细菌总DNA，分别扩增3种纤维分解菌目的DNA片段，并连接至pMD-18 T Vector上，经PCR和测序鉴定后，以不同稀释度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应。结果显示，扩增得到的3种瘤胃纤维分解菌目的片段与已知菌种相应片段的同源性大于99%；以不同稀释度重组pMD-18 T为模板建立的荧光定量PCR扩增曲线差异明显，绘制标准曲线的相关系数均接近1，熔解曲线均呈单一峰值。因此，本试验成功建立了3种瘤胃主要纤维分解菌的实时定量PCR方法，为减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫研究奠定了基础。瘤胃纤维分解菌；Real-time PCR；标准曲线；     

荧光定量PCR检测牛性别相关基因DAX1表达的标准质粒和标准曲线的构建

本研究根据GenBank中登录的剂量敏感的性别反转－先天性肾上腺发育不良基因1(dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1，DAX1)设计引物，构建包含DAX1基因cDNA片段的质粒，作为中国荷斯坦牛DAX1基因mRNA定量检测的标准品，建立了DAX1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法。结果表明，该方法特异性好，检测灵敏度达102拷贝，线性范围为102～106拷贝，阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值间有着良好的线性关系(r=0.99975),扩增效率高(E=100%)，可以作为检测牛DAX1基因mRNA定量检测方法。     

绵羊DECR1基因exon 5部分序列多态性分

试验根据GenBank登录的牛2,4-双烯-CoA还原酶1（2,4-dienoyl-CoA reductase1，DECR1）基因序列（NP_001068891）设计引物，应用PCR技术对德国美利奴绵羊、杜泊绵羊、特克塞尔绵羊DECR1基因的exon 5部分序列进行克隆测序；利用PCR-SSCP技术检测了3个绵羊群体exon 5单链构象多态性（SNP），所获序列与GenBank中其他物种exon 5序列进行了同源性比较，并构建了亲缘关系聚类分析图。结果表明，绵羊DECR1基因exon 5长为137 bp，3个绵羊群体中exon 5均不存在SNPs，各种动物之间DECR1基因exon 5的同源性较高，在81.02%（鸡）～97.08%（牛）之间，其中绵羊和牛同源性最高，达到97.08%；与鸡的同源性最低，为81.02%；聚类分析结果显示，绵羊首先与牛聚为一类，再分别与兔子、狗聚为一类，最后分别与人、猪聚为一类，绵羊与牛的亲缘关系最近，与鸡的亲缘关系最远，与传统分类相一致，说明DECR1基因exon 5在动物进化过程中高度保守。