导入APX基因提高了普那菊苣植株的抗逆性

采用农杆菌介导的方法,把CaMV35S启动子驱动的来自棉花(Gossypium spp.)的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)基因导入普那菊苣(Cichorium intybus L.cv.Puna)。结果表明:经过卡那霉素(Km)筛选和对抗性植株的PCR和Southern杂交分析,证明APX基因成功地整合到普那菊苣基因组中。转APX基因普那菊苣植株对NaCl和甘露醇胁迫表现出一定的抗性,在NaCl浓度为500mmol·L^-1、甘露醇浓度为30g·L^-1的条件下,转APX基因不定芽能够正常生根和生长,转基因植物叶片外植体能够形成愈伤组织和再生植株,而野生型植株不定芽不能正常生根、已生根幼苗不能正常成长,野生型植株叶片不能形成愈伤组织。     

红三叶新品系组织培养和植株再生

利用红三叶(Trifolium pratense L.)新品系无菌苗不同部位,通过愈伤组织诱导及分化途径获得再生植株。结果表明:子叶、下胚轴、叶柄、叶片及根段在MS+0.5mg·L^-1 6-BA+1～2mg·L^-1 2,4-D培养基上都极易诱导出愈伤组织。最佳继代培养基为MS+0.5mg·L^-1 6-BA+1.0mg·L^-1 2,4-D,添加2,4-D比NAA更利于愈伤的增长和保存;最佳分化培养基为MS+0.75mg·L^-1 6-BA+0.5mg·L^-1 NAA,最高分化率为16.67%,且分裂素6-BA优于KT,6-BA与NAA组合比与IBA组合更有利于红三叶愈伤组织的分化;茎芽增殖最佳培养基为MS+0.5mg·L^-1 6-BA+1.0mg·L^-1 IBA,再生苗的增殖效果IBA>NAA,2,4-D不利于茎芽生长;最佳生根条件为50mg·L^-1浓度的IBA中浸泡1h后植入含0.5mg·L^-1 IBA的MS中,生根率达80%,红三叶新品系IBA生根最大极限浓度为0.75mg·L^-1,浓度过高表现出对根系生长的毒害。     

野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究

以呼伦贝尔草原野生黄花苜蓿(Medicago falcata L.)无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,对其组织培养及再生体系进行系统的研究,以期为其下一步转基因试验提供良好的受体。结果表明:最佳愈伤诱导培养基为MS+1.5 mg·L^-1 2,4-D+0.4 mg·L^-1 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂,下胚轴和子叶的最佳愈伤诱导率均可达到100%。最佳胚性愈伤形成培养基为MS+0.5 mg·L^-1 KT+0.1 mg·L^-1 NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂,胚性愈伤形成率为81.5%;最佳分化芽形成培养基为MS+0.25 mg·L^-1 KT+0.05 mg·L^-1 NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂,分化芽形成率为36.5%。最佳生根培养基为1/2MS+0.5 mg·L^-1 NAA+1.5%蔗糖+0.7%琼脂,生根率为93.3%。愈伤诱导结果显示,供试黄花苜蓿材料个体间组织培养再生性存在较大差异,在同一激素水平上有大约1/3植株的愈伤状态优于其他植株。     

Lyz-GFP双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化

利用农杆菌介导法将溶菌酶(Lyz)与绿色荧光蛋白(GFP)基因转入"甘农1号"杂花苜蓿(Medicago sativa Martyn)和"甘农3号"紫花苜蓿(Medicagosativa L.)品种中,获得含有该双元基因的苜蓿转基因愈伤组织;采用荧光检测和PCR扩增技术,检测到溶菌酶Lyz和绿色荧光蛋白GFP基因在苜蓿愈伤细胞中的表达;研究该双元基因在苜蓿品种"甘农1号"和"甘农3号"中转化的若干影响因素,确定适宜的转化条件以期提高基因转化效率。结果表明:75 mg·L^-1的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长具有显著抑制效应;300mg·L^-1头孢霉素能够有效地抑制农杆菌LBA4404的生长;OD₆₀₀值为0.4-0.5的农杆菌适宜的侵染时间是10min;经预培养3-4d的材料侵染后再共培养3d之后,在愈伤组织诱导培养基MS₊2,4-D 2.0mg·L^-1+KT0.5 mg·L^-1+0.6%琼脂+2.5%蔗糖的培养基上诱导出抗性愈伤组织;"甘农1号"和"甘农3号"的抗性愈伤组织诱导率分别为35%和32%。     

红豆草组织培养及植株再生体系的优化

以红豆草（Onobrychis viciifolia Scop.）无菌苗的上胚轴、真叶和下胚轴为外植体,根据正交试验设计方法,研究不同植物激素对红豆草组织培养及植株再生体系的影响。结果表明：激素对愈伤诱导的影响程度为萘乙酸（Naphthylacetic acid,NAA）>玉米素（Zeatin,ZT）> 6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine,6-BA）,诱导外植体产生愈伤组织的最佳培养基为MS+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 ZT,诱导率达94.5%;对不定芽分化率的影响程度为NAA > 6-BA > ZT,诱导愈伤组织分化不定芽的最佳培养基为MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+2.5 mg·L^-1 ZT,诱导率达88.9%;诱导不定芽生根的最佳培养基为1/2 MS+0.5 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1吲哚丁酸钾（Indole-3-butyric acid potassium,IBA-K）,诱导率高达45%。     

不同组培基质对菊苣叶片再生的影响

以3个菊苣（Cichorium intybus L.）品种叶片为外置体,以MS,N6,B5,SH和N6B5MS为基本培养基,添加不同激素对其不定芽诱导及植株再生进行研究。结果表明：3个菊苣品种在5种培养基上的愈伤诱导率和分化率存在差异,其中以MS培养基添加2.0 mg·L^-16-BA和0.2 mg·L^-1 IBA再生和分化最好,平均愈伤诱导率和分化率分别为70.12%和72.07%。在不同生根培养基中,生根率和根长存在一定的差异,生根数量没有显著差异,其中以1/2MS培养基中添加0.1 mg·L^-1的NAA效果最显著,生根率、每个外植体的平均根数和根长分别达到97.07%,4.03个和6.51 cm。     

AtNHX1基因对菊苣的转化和耐盐性研究

用农杆菌介导法将AtNHX1基因导入菊苣中,共获得42株卡那霉素(Kan)抗性再生植株。经过PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测表明,AtNHX1基因已成功整合到菊苣基因组中,并且能够正常转录。野生型和转基因植株诱发的愈伤组织进行耐盐生长试验,结果显示,相同盐胁迫条件下,转基因愈伤组织的相对生长率显著高于野生型愈伤组织。施加梯度NaCl胁迫后,植株叶片K⁺和Na⁺含量测定结果显示,转基因植株叶片比野生型积累更多的Na⁺和K⁺,维持较高的K⁺/Na⁺;叶片相对电导率测定结果表明,转基因株系叶片相对电导率显著低于野生型。上述结果表明,AtNHX1基因的导入和表达在提高菊苣耐盐性的同时减轻了盐胁迫对植物细胞膜的伤害。     

青绿苔草(Care breviculmis)愈伤组织诱导与再生体系的建立

为建立青绿苔草高效的再生体系,本研究以青绿苔草的种子为外植体,探究不同植物激素配比对愈伤组织诱导、愈伤分化和生根的影响。结果表明:MS+1.5 mg·L^-1 NAA+0.5 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2,4-D为诱导愈伤的最佳培养基,诱导率可以达到68.3%,愈伤表现为松散的黄色颗粒;MS+1.0 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 6-BA为最佳分化培养基,分化率为93.8%,不定芽数量达到40个,长势良好;不定芽在1/2 MS培养基中生根效果最好,其根长、株高和生根数量均显著高于其他处理。本研究建立了高效的青绿苔草再生体系,为研究青绿苔草的遗传转化及应用生物技术育种奠定了基础。     

紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究

为在不同栽培苜蓿(Medicago sativa)品种上，建立稳定、快速且高效的组织培养体系，本试验以品种'游客’、'Paola’和'Sardi7’为研究材料，探究了苜蓿外植体、激素配比及金属离子(Cu²⁺、Ag⁺)，对其胚性愈伤组织的诱导效果。结果表明：下胚轴为诱导愈伤组织的最佳外植体；MS+1 mg·L^-12,4-D+0.2 mg·L^-1 KT为培养基时'游客’和'Paola’胚性愈伤诱导率分别为24.7%，16.7%；MS+2 mg·L^-12,4-D+0.2 mg·L^-1 KT为培养基时'Sardi7’胚性愈伤诱导效果最佳为27.3%；1 μmol·L^-1 和5 μmol·L^-1 Cu²⁺均能显著促进'Sardi7’'游客’和'Paola’愈伤组织的诱导；5 μmol·L^-1 Ag⁺显著诱导'游客’和'Paola’形成胚性愈伤组织，诱导率分别提高25.3%,46.7%(P<0.05)。本研究探索了诱导苜蓿愈伤组织的最佳外植体及其培养条件、金属离子促进不同苜蓿品种再生的作用，为突破同源四倍体栽培苜蓿品种基因型上的限制、提高胚性愈伤组织出愈率提供了思路。     

偏关苜蓿种子萌发及植株再生体系优化

本试验以偏关苜蓿（Medicago sativa ‘Pianguan’）种子为材料,从不同消毒剂、培养基成分对种子萌发以及不同激素及浓度配比对愈伤组织诱导分化的影响等方面展开研究。结果表明：0.1% HgCl₂消毒6 min后置于1/4MS培养基上的种子发芽率、发芽势较高,霉烂率低;不同外植体的最优愈伤诱导培养基为MS+2 mg·L^-1 2,4-D+0.4 mg·L^-1KT,下胚轴与子叶最高诱导率分别为100%和98%;最优愈伤分化培养基为UM+1.6 mg·L^-1KT,下胚轴与子叶最高分化率分别为59%和44%;不定芽转至1/2MS生根培养基,生根率达64%。本研究系统构建了优化的偏关苜蓿植株再生体系,可为后续遗传转化提供技术支撑。     

两种抗生素的效价比及其对甘农3号紫花苜蓿愈伤组织生长发育的影响

两种抗生素羧苄青霉素和头孢霉素对农杆菌LBA4404的抑菌效果及其对甘农3号紫花苜蓿愈伤组织的生长、体细胞胚分化的影响进行了研究。结果表明,羧苄青霉素的抑菌效果较好,适宜浓度为200~300 mg/L;在浓度200~400 mg/L的羧苄青霉素可促进芽分化;头孢霉素对甘农3号下胚轴离体培养的毒性大,浓度为600 mg/L时完全抑制芽分化。因此,羧苄青霉素为适宜抑菌剂,愈伤诱导阶段的适宜浓度为300 mg/L,体胚形成及芽诱导分化阶段的适宜浓度为200 mg/L。     

长叶点地梅愈伤组织诱导和植株再生

以长叶点地梅（Androsace longifolia）的无菌实生苗的下胚轴和叶片为外植体,研究不同种类、不同浓度的激素组合培养对愈伤组织诱导、芽诱导和生根的影响。结果表明,诱导下胚轴基部愈伤组织的最佳培养基为MS+0.3 mg·L-1 6 BA+0.1 mg·L-1 NAA,诱导率达85%;诱导叶片愈伤的最佳培养基为MS+0.02 mg·L-1 NAA+0.3 mg·L-1 TDZ,诱导率为80%;下胚轴愈伤诱导芽的最佳培养基为MS+0.5 mg·L-1 6 BA+0.2 mg·L-1 NAA,分化率达92.5%;叶片愈伤诱导芽的最佳培养基为MS+1.0 mg·L-1 6 BA+0.2 mg·L-1 NAA,分化率达82.5%;最佳生根培养基为MS+1.0 mg·L-1 IBA,生根率达100%,移栽成活率达95%。     

菊苣再生体系建立及转AFL2基因的研究

以菊苣叶片为外植体,研究建立高效再生体系和农杆菌介导的稳定转化体系.结果表明:再生频率从48%提高至100%;单叶盘再生芽数达12个;试管苗叶片与农杆菌菌株PIG 121 Hm共培养3 d,在附加卡那霉素20 mg/L和头孢霉素600 mg/L再生培养基上选择培养2周后,叶片再生出转化芽,绿芽率达8.6%,转化芽在附加30 mg/L卡那霉素培养基中长大并继代增殖,初步鉴定是转化芽.     

菊苣组织培养与植株再生的研究

以菊苣叶片、茎段，花蕾和花瓣为外植体，进行离体培养试验，结果表明，叶片，茎段，花蕾可产生淡黄色的愈伤组织，并可诱导出不定芽，出愈率为100％，叶片和茎段的分化率为100％，诱导愈伤组织及分化的最佳培养基为：MS＋BA 2mg/L IBA0.3mg/L，生根培养基为：1／2MS＋NAA 0．1mg/L，生根率为100％。     

乌拉尔甘草离体再生与遗传转化技术的研究

研究乌拉尔甘草离体再生受体系统和遗传转化技术方法,为甘草基因工程育种提供前期实验基础。以乌拉尔甘草茎段为外植体,试验筛选最适不定芽分化培养基和增殖壮苗培养基; 以乌拉尔甘草茎段为受体,利用农杆菌介导法对乌拉尔甘草进行GUS和GFP基因的遗传转化研究。结果表明,以乌拉尔甘草去腋芽茎段为外植体,其不定芽最适分化和增殖培养基配方为MS+0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6BA+0.1 mg/L IBA,不定芽分化率达38.8%,增殖倍数3.67,适宜的壮苗培养基为MS+0.5 mg/L NAA。与去腋芽茎段相比,带腋芽茎段的不定芽分化率达100%,能够在含抗生素的选择培养基MS+0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6BA+0.1 mg/L IBA+50 mg/L Kan+250 mg/L Car上存活,确定为最适转化受体;带腋芽茎段在分化培养基上预培养7 d后,经OD₆₀₀=0.6的菌液侵染10 min,共培养3 d,在选择培养基上培养20 d,其不定芽分化率为43.75%,经GFP荧光检测可得到78.88%的GFP基因瞬时表达率;随机选取5株再生转化植株,经PCR检测,均有GFP和GUS基因的目的条带,GFP基因表达较强烈,初步获得了5个株系的阳性转化植株。     

农杆菌介导犁苞滨藜NHX基因转化苜蓿的影响因素

以新牧1号杂花苜蓿(Medicago varia Martin.cv.Xinmu No.1)和新疆大叶苜蓿(Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye)无菌苗叶片和子叶为材料,通过根癌农杆菌EHA105介导转化犁苞滨藜NHX耐盐基因,提高植株耐盐性。本文对农杆菌转化条件进行研究,结果表明:以预培养3d的子叶为转化受体,菌液浓度OD₆₀₀为0.4～0.5时,浸染10～15min,然后转入附加20～30mg/L乙酰丁香酮的共培养基,培养4d,可以获得较高的转化效率;对抗性芽的PCR检测初步证明,外源基因整合到苜蓿的基因组中。     

铁线莲‘Blekitny Aniol’组织培养及再生体系建立

对铁线莲(Clematis florida‘Blekitny Aniol’)的带芽茎段进行诱导产生无菌苗,并对其叶片和茎段进行愈伤组织诱导成苗的分化研究,成功建立了铁线莲组织培养再生体系。结果表明,带芽茎段诱导腋芽最佳培养基为MS+1mg·L~(-1)6-BA+0.05 mg·L~(-1)NAA,腋芽萌发率为100.0%;茎段诱导愈伤最适宜培养基为MS+2 mg·L~(-1)6-BA+0.01mg·L~(-1)NAA,诱导率为78.3%;叶片诱导愈伤组织最适宜的培养基为MS+1 mg·L~(-1)6-BA+0.1 mg·L~(-1)NAA,诱导率为81.7%;愈伤组织分化的最佳培养基为1/2MS+1 mg·L~(-1)6-BA+0.05 mg·L~(-1)NAA,分化率可达25.0%;最适宜不定芽的增殖培养基为1/2MS+3 mg·L~(-1)6-BA+0.1 mg·L~(-1)NAA,增殖倍数为4.94;筛选出最优的生根培养基组合为1/2MS+0.05 mg·L~(-1)NAA,生根率为70.2%。本研究将为铁线莲的推广应用提供参考,也为其他铁线莲属植物引种和开发利用奠定了基础。