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相似文献
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1.
牛分枝杆菌是严重危害养牛业的重要人兽共患病原微生物,PCR是检测该病原的有效手段之一。本研究通过筛选最佳的PCR检测方法,以期为临床监测牛分枝杆菌感染提供技术参考。针对牛分枝杆菌4种常见的特异性基因(16S rRNA、IS6110、IS1081和Mpb64)分别设计引物,通过温度梯度PCR法确定最适退火温度;采用牛分枝杆菌参考株核酸确定PCR最小检测限,同时运用牛分枝杆菌国内参考株、牛分枝杆菌国际参考株、禽分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌、羊种布鲁菌以及牛种布鲁菌进行特异性比较试验;最后运用人工模拟牛分枝杆菌感染组织样本(肺脏、淋巴结、奶样)比较不同PCR方法检测效果。4对引物以60℃为退火温度时均能检测分枝杆菌,其中IS6110、IS1081和Mpb64基因引物可以特异性检测牛分枝杆菌。IS6110和IS1081基因引物对牛分枝杆菌基因组的检测灵敏度最高,可达10-10 ng/μL;IS6110基因引物在肺脏和淋巴结中牛分枝杆菌检测灵敏度可达106 CFU/mL以上,而Mpb64基因引物对奶样中牛分枝杆菌的检测灵敏度可达10...  相似文献   

2.
为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的三重PCR方法,本研究以M bovis ValleeⅢ株染色体DNA 为模板,分别以其recA、IS6110、IS1081基因特异性引物进行PCR扩增,建立检测M.bovis的recA-IS6110-IS1081三重PCR反应.通过PCR扩增获得大小约为860 bp、520bp和340 bp的DNA片段.BLAST序列分析表明,这3个基因片段与GenBank中登录的相关基因的核苷酸序列同源性均达到99%.同时,recA、IS6110和IS1081PCR扩增的敏感性分别达到585fg、19.5fg和19.5fg.特异性较强,只有M.bovis和人结核临床分离株扩增反应为阳性,为进一步研究recA、IS6110和IS1081基因以及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础.  相似文献   

3.
本研究基于IS1081基因建立了鉴定犬结核的SYBR Green荧光定量PCR方法.在最佳反应条件下反应效率为1.09,获得的标准曲线相关系数R值达0.999 5,标准曲线的线性范围达到1~1×107拷贝8个数量级,最低可检测到约10个目的拷贝,即31.4 fg DNA.根据溶解曲线分析,扩增产物中无引物二聚体的影响,说明所设计引物特异,退火温度合适.这表明本研究建立的SYBR Green荧光定量方法灵敏度高、定量范围广.利用该方法对临床样品进行检测,结果发现:与结核杆菌分离培养方法比较,符合率为85%.240份犬猫鼻拭子中150份被检测为阳性,这说明犬猫鼻腔中分枝杆菌携带率很高.  相似文献   

4.
本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%(17/18)。因此,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。  相似文献   

5.
为筛选及评价用于牛结核病诊断的抗原,本试验将CFP-10、ESAT-6、TB10.4、TB27.4、MPT51、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83、Rv3872和Ag85B共11种牛分枝杆菌抗原分别作为包被抗原建立间接ELISA方法,比较其对牛结核病的检出率;同时利用豚鼠和牛的皮试试验评价重组蛋白作为皮试试验刺激原的潜力。此外,将重组蛋白分别刺激结核病阳性牛和阴性牛的抗凝血24 h,检测血浆中的IFN-γ水平,评价各重组蛋白作为IFN-γ释放试验刺激原的潜力。结果显示,不同重组蛋白对结核病阳性血清的反应活性不一,MPB70总检出率最高,为59.7%;其次是Ag85B、ESAT-6和MPB83,检出率均在45%以上;MPT51的检出率最低,仅为2.2%。豚鼠和牛皮试试验均显示,单个重组蛋白作为刺激原难以产生令人满意的迟发型过敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH),而TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63或Rv3872作为补充抗原,分别与CFP-10或ESAT-6混合,均可特异性地刺激结核病阳性牛产生较强的DTH反应,且与PPD-B无显著差异(P>0.05)。重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4和MPT51均能刺激结核病牛全血释放一定的IFN-γ,其中CFP-10、CFP-10-ESAT-6串联蛋白和MPT51刺激结核病阳性牛全血释放的IFN-γ显著高于阴性牛(P<0.05)。因此,这11种牛分枝杆菌抗原并不适合单独用于牛结核病的血清学诊断、皮试试验或IFN-γ释放试验,但以CFP-10和ESAT-6为核心,TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63、Rv3872或MPT51作为其补充抗原,均能提高检测敏感性,有作为皮试试验和IFN-γ释放试验特异性刺激原用于牛结核病诊断的潜力。  相似文献   

6.
本研究旨在运用多重PCR联合变性高效液相色谱(DHPLC)技术原理,建立快速检测人兽结核致病菌群并鉴别主要致病菌种的新方法。建立了四重PCR-DHPLC方法,可同时检测结核分枝杆菌复合群(MTC)特异的IS6110和IS1081插入序列、结核分枝杆菌特异结构基因和牛分枝杆菌特异结构基因共4个目标基因。采用13种分枝杆菌标准菌株和分离株以及23种常见微生物样品进行特异性试验,采用纯化标准菌株DNA以及克隆了扩增序列的重组质粒DNA进行检测灵敏度试验,采用从临床疑似发病牛群采集的牛组织样品进行临床检测试验,并与细菌分离培养方法进行比对。结果表明:所建立的多重PCR-DHPLC方法能特异检测MTC并准确鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,而对其它11种分枝杆菌以及23种常见微生物样品均呈典型阴性检测结果;检测灵敏度达到每个反应102~103基因拷贝或3.6~6.8fg DNA模板浓度。采用该法从39份临床疑似样品中检出33份MTC阳性并检出其中28份为牛分枝杆菌阳性,而培养法检出21份阳性样品。采用该法临床检测全程可缩短至1d之内,其中对纯化DNA样品的检测分析可在2h内完成。本研究为人兽结核致病菌(群)的快速检测鉴别提供了新型分子生物学方法,所建立的四重PCR-DHPLC方法能实现快速检测结核分枝杆菌复合群并鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌  相似文献   

7.
目的:利用可以鉴别分支杆菌属中结核分枝杆菌、牛分支杆菌、非结核分枝杆菌多重PCR方法,检测奶牛场麻雀组织中分支杆菌感染情况。方法根据结核分枝杆菌种特异基因目的片段MTP40、分枝杆菌属特异基因32kD、结核分枝杆菌复合群特异基因IS6110插入序列,设计合成三对特异性引物,扩增对32kD的506bp、MTP40的396bp和IS6110的984bp片段,以此方法检测奶牛场麻雀肺组织中分支杆菌感染情况,并对阳性结果的目的片段进行克隆测序。结果在分析的21份麻雀肺组织中,检测出2例非结核分枝杆菌阳性病料,阳性率9.52%。2例阳性样本PCR扩增得到的片段与GenBank收录的32kD基因同源性分别为95.8%和97.2%。结论麻雀肺组织中存在分支杆菌感染阳性病例提示该牛场中生物体内存在分支杆菌潜伏感染,并可能导致奶牛的潜伏感染以及干扰结核检疫。  相似文献   

8.
11种牛分枝杆菌抗原在牛结核病诊断中的初步评价   总被引:1,自引:1,他引:0  
为筛选及评价用于牛结核病诊断的抗原,本试验将CFP-10、ESAT-6、TB10.4、TB27.4、MPT51、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83、Rv3872和Ag85B共11种牛分枝杆菌抗原分别作为包被抗原建立间接ELISA方法,比较其对牛结核病的检出率;同时利用豚鼠和牛的皮试试验评价重组蛋白作为皮试试验刺激原的潜力。此外,将重组蛋白分别刺激结核病阳性牛和阴性牛的抗凝血24h,检测血浆中的IFN-γ水平,评价各重组蛋白作为IFN-γ释放试验刺激原的潜力。结果显示,不同重组蛋白对结核病阳性血清的反应活性不一,MPB70总检出率最高,为59.7%;其次是Ag85B、ESAT-6和MPB83,检出率均在45%以上;MPT51的检出率最低,仅为2.2%。豚鼠和牛皮试试验均显示,单个重组蛋白作为刺激原难以产生令人满意的迟发型过敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH),而TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63或Rv3872作为补充抗原,分别与CFP-10或ESAT-6混合,均可特异性地刺激结核病阳性牛产生较强的DTH反应,且与PPD-B无显著差异(P0.05)。重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4和MPT51均能刺激结核病牛全血释放一定的IFN-γ,其中CFP-10、CFP-10-ESAT-6串联蛋白和MPT51刺激结核病阳性牛全血释放的IFN-γ显著高于阴性牛(P0.05)。因此,这11种牛分枝杆菌抗原并不适合单独用于牛结核病的血清学诊断、皮试试验或IFN-γ释放试验,但以CFP-10和ESAT-6为核心,TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63、Rv3872或MPT51作为其补充抗原,均能提高检测敏感性,有作为皮试试验和IFN-γ释放试验特异性刺激原用于牛结核病诊断的潜力。  相似文献   

9.
本试验应用建立的三重PCR反应检测256份血液样本,结果其中的2份样本呈阳性.应用在线blast进行同源性比较,结果发现,牛分枝杆菌特异性基因IS6110,IS1081和recA与牛分枝杆菌AF2122/97株的同源性均达到99%以上.  相似文献   

10.
《中国兽医学报》2014,(9):1486-1490
CFP-10和ESAT-6是牛分枝杆菌的免疫优势抗原,可诱导机体产生IFN-γ,在牛结核病的免疫诊断中发挥重要作用。本试验分别克隆了牛分枝杆菌CFP-10和ESAT-6基因,并将这2个基因融合扩增,构建重组表达质粒pET28a/CFP-10-ESAT-6,重组质粒在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。重组蛋白主要以分泌表达的形式存在于表达上清中,收集上清中的目的蛋白进行Ni亲和层析柱和分子筛两步纯化,蛋白纯度分别达到90%和95%。将纯化的重组蛋白以2mg/L的质量浓度包被酶标反应板,用间接ELISA方法检测不同来源牛血清中的结核病抗体,结果表明,表达的重组融合蛋白具有良好的抗原活性,可有效识别阴、阳性结核病血清。  相似文献   

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