鸡传染性支气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LT95Ⅰ株病毒攻击的免疫保护

将共表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)SI基因和鸡干扰素.丫基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγ S1)接种4周龄SPF鸡,免疫3周后用同源(LX4株)及异源强毒株(LTJ951)攻毒,评价重组疫苗对异源病毒的保护作用.结果显示,重组疫苗接种1周后,免疫鸡产生抗IBV的抗体;而且外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞的含量略高于非免疫对照组;攻毒后,异源强毒株攻毒的免疫组CD4+T淋巴细胞呈下降趋势,并且该组低水平CD4+的状态一直持续到试验结束,而其他组CD4+T淋巴细胞均迅速上升,峰值达到14.5%;同源强毒株攻毒的免疫组CD8+T淋巴细胞呈高水平的表达,而其他组攻毒后均无明显变化;保护率结果显示,同源强毒株攻毒免疫组的发病率和死亡率为21.43%和0%,与其他各组相比均有显著差异;另外同源强毒株攻毒的免疫组病理损伤与异源强毒株攻毒的试验组相比明显减轻,其排毒时间和排毒量也均有所减少;强毒攻毒后所有试验组体重无显著差异.以上结果可以说明,重组疫苗能对同源强毒株产生较好的免疫保护,但不能对遗传关系较远的强毒株产生有效的免疫应答.     

鸡传染性支气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LTJ95Ⅰ株病毒攻击的免疫保护

将共表达鸡传染性支气管炎病毒（mv）S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒（rFPV—IFN-γ S1）接种4周龄SPF鸡,免疫3周后用同源（LX4株）及异源强毒株（LTJ95I）攻毒,评价重组疫苗对异源病毒的保护作用。结果显示,重组疫苗接种1周后,免疫鸡产生抗IBV的抗体;而且外周血中CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞的含量略高于非免疫对照组;攻毒后,异源强毒株攻毒的免疫组CD4^＋T淋巴细胞呈下降趋势,并且该组低水平CD4^＋的状态一直持续到试验结束,而其他组CD4^＋T淋巴细胞均迅速上升,峰值达到14．5％;同源强毒株攻毒的免疫组CD8^＋T淋巴细胞呈高水平的表达,而其他组攻毒后均无明显变化;保护率结果显示,同源强毒株攻毒免疫组的发病率和死亡率为21．43％和0％,与其他各组相比均有显著差异;另外同源强毒株攻毒的免疫组病理损伤与异源强毒株攻毒的试验组相比明显减轻,其排毒时间和排毒量也均有所减少;强毒攻毒后所有试验组体重无显著差异。以上结果可以说明,重组疫苗能对同源强毒株产生较好的免疫保护,但不能对遗传关系较远的强毒株产生有效的免疫应答。     

传染性支气管炎重组鸡痘病毒免疫鸡对LHLJ04X I株病毒攻击的免疫保护作用

将表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IFN-γ S1）接种SPF鸡后,用与S1基因亲本毒株具有相同致病型且遗传关系较近的现地分离株LHLJ04XI病毒进行攻击．评价重组疫苗对现地分离病毒的保护效果。结果显示,重组病毒在免疫后1周即可检出ELISA抗体,并且免疫组外周血CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量均有显著上升。当用LHLJ04XI株病毒及亲本毒LX4攻击后,免疫鸡的肝脏、肾脏、脾脏及肺脏等脏器的病理损伤程度明显轻于非免疫对照组,排毒时间缩短,攻毒后现地分离株攻击的免疫组的发病率为27.3％（3／11）,死亡率为9．1％（1／11）,亲本毒攻击的免疫组发病率为26．67％（4／15）,死亡率为6．67％（1／15）,两者没有明显差异,而非免疫对照组的发病率和死亡率分别为100％（11／11）和45．5％（5／11）,与免疫组相比差异显著,说明重组疫苗对免疫鸡具有较好的保护效果。体重测定结果表明,攻毒前重组疫苗免疫组和非免疫对照组的体重差异不显著（P〉0．05）,攻毒以后免疫组体重的增加幅度高于非免疫对照组。以上结果表明,共表达鸡IFN-^γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒活载体疫苗能对异源现地分离株的攻击产生较好的免疫保护,同时也减轻了重组疫苗对体重增长的抑制作用。     

鸡传染性支气管炎病毒重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LTJ95I株病毒攻击的免疫保护

rFPV-IFNγS1是一株共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒,将其接种SPF鸡3周后,用传染性支气管炎病毒异源毒株LTJ95I攻击.结果显示,疫苗接种后1周,免疫鸡血清抗体很快产生,外周血中CD4 和CD8 T淋巴细胞的百分含量略高于非免疫对照组,但这种差异并不显著.攻毒后保护率结果显示,该疫苗不能对异源病毒提供坚强保护,攻毒后免疫组的发病率为6O%(6/10),病死率为30%(3/10),非免疫对照组的发病率和病死率分别为73%(8/11)和27%(3/11);两组的病理损伤程度差异不明显,在排毒时间上也没有明显变化.     

共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒部分生物学特性测定

将共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγS1)接种4周龄SPF鸡,免疫3周后用异源病毒LSC99I株攻击,考察重组疫苗对异源病毒攻击的保护作用。结果显示,疫苗接种后,免疫鸡血清中很快出现抗体;外周血中CD4 和CD8 T淋巴细胞的百分含量略高于非免疫对照组,但这种差异并不显著。LSC99I株IB病毒攻击后的保护率结果表明,免疫组的发病率为50%(5/10),死亡率为20%(2/10),非免疫对照组的发病率为100%(10/10),死亡率为50%(5/10);另外免疫鸡的病理损伤程度与非免疫对照组相比,二者差异不明显,在排毒时间和排毒量上也没有明显变化。体重分析结果显示,攻毒前免疫组与对照组相比,体重均没有显著变化,但攻毒后免疫组鸡体重增长的幅度要高于非免疫对照组。从以上结果可以说明,重组疫苗虽然能在动物体内很好地表达,但不能对实验动物产生很好的保护作用,而鸡干扰素-γ基因能在动物体内表达并发挥其免疫调节作用,减轻了重组疫苗对体重增长的影响。     

鸡IFN-γ重组鸡痘病毒对鸡传染性腔上囊炎MB43弱毒疫苗免疫鸡免疫应答的影响

将重组鸡痘病毒（rFPV—IFN-γ）与IBDMB43弱毒疫苗联合接种SPF鸡，研究重组鸡IFN-γ对IBD疫苗免疫效果的影响。结果显示，rFPV—IFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组（MB43＋rFPV-IFN-）＂）及rlFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组（MB43＋rIFN-γ）在免疫后第2周即可检出ELISA抗体，比MB43疫苗单独免疫组早1周。用IBDVGx株攻击后，MB43＋rFPV-IFN-γ组和MB43＋rIFN-γ组免疫鸡的脾只有个别淋巴细胞核浓缩、核崩解，少数滤泡萎缩变性坏死；胸腺损伤程度轻于MB43疫苗单独免疫组和非免疫对照组。免疫后1周，3个免疫组外周血CD8^＋T淋巴细胞含量均显著高于非免疫对照组，CD4^＋T淋巴细胞含量变化不明显；攻毒后第2周，3个疫苗免疫组CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量均显著升高，各组之间CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量无明显差异。证实，rFPV—IFN-γ和rIFN-γ可加强疫苗的细胞免疫和体液免疫应答。     

2012年山东鸡传染性支气管炎病毒分离株遗传进化和免疫保护分析

从2012年山东省发病商品鸡群中分离鉴定了9株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),并对其S1基因进行了序列测定和分析。遗传进化分析发现,9个IBV流行株和国内外参考毒株可分成4个基因型。其中8个IBV流行株属于以QX为代表的基因I型,而SDIB781/2012与其他8个流行株遗传距离较远,属于基因IV型。为明确现有弱毒活疫苗对IBV流行株的免疫保护效力,分别用491、2886、MA5和H120弱毒疫苗免疫3日龄SPF鸡,14d后用流行株SDIB821/2012进行攻毒。根据攻毒后试验鸡发病死亡情况,491免疫组保护率为90%;与对照组相比,2886、MA5和H120免疫组几乎没有保护效力。但是攻毒后3、5和7d各免疫组和对照组试验鸡气管、肺和肾脏组织病毒检出率没有明显差异,表明4种IB疫苗均不能有效抵抗病毒在试验鸡气管、肺脏和肾脏组织内复制。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因和鸡II型干扰素基因在重组鸡痘病毒中的共表达

将鸡II型干扰素(ChIFNγ)基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插入到鸡痘病毒转移载体中,构建含有这2个基因的鸡痘病毒转移载体pSY-ChIFNγS1。采用脂质体法将该质粒转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经过8轮蓝斑筛选,得到纯化的能够同时表达鸡II型干扰素和鸡传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒rFPV-ChIFNγS1。rFPV-ChIFNγS1接种28日龄的SPF鸡1周后,可以检测到针对传染性支气管炎病毒S1基因的ELISA抗体,重组病毒接种鸡的CD4+、CD8+和γδTCR阳性T淋巴细胞的百分比含量显著高于非免疫对照鸡(P<0.05);免疫4周后用传染性支气管炎LX4强毒株攻击,rFPV-ChIFNγS1免疫组仅有1只出现轻微的呼吸道症状(1/16),而非免疫对照组则有16只发病(16/16),并有2只出现死亡(2/16),表明rFPV-ChIFNγS1对接种鸡可以产生良好的保护效果。     

鸡传染性支气管炎弱毒疫苗NNA对黄鸡的免疫保护效力评估

传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是一种急性、高度接触传染的病毒性疾病。该病的防控主要是通过弱毒疫苗和灭活苗的使用。本研究应用包括4/91型的弱毒疫苗NNA的不同疫苗组合分别在1日龄和10日龄对黄鸡进行免疫。二免后2周用IBV QX型强毒株HSJ/2016攻毒以检验不同组合疫苗的保护作用,攻毒前检测血清抗体效价。实验结果显示,1日龄一免使用威支灵和NNA组合,10日龄二免单独使用NNA的免疫程序能够显著增强鸡体的免疫应答,对IBV流行强毒达到最好保护效果。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因和鸡Ⅱ型干扰素基因在重组鸡痘病毒中的共表达

将鸡Ⅱ型干扰素（ChIFNγ）基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插人到鸡痘病毒转移载体中，构建含有这2个基因的鸡痘病毒转移载体pSY—ChIFNγS1。采用脂质体法将该质粒转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞（CEF），经过8轮蓝斑筛选，得到纯化的能够同时表达鸡Ⅱ型干扰素和鸡传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒rFPV—ChIFNγS1。rFPV—ChIFNγS1接种28日龄的SPF鸡1周后，可以检测到针对传染性支气管炎病毒S1基因的ELISA抗体，重组病毒接种鸡的CD4^＋、CD8^＋和γδTCR阳性T淋巴细胞的百分比含量显著高于非免疫对照鸡（P％0．05）；免疫4周后用传染性支气管炎LX4强毒株攻击，rFPV—ChIFNγS1免疫组仅有1只出现轻微的呼吸道症状（1／16），而非免疫对照组则有16只发病（16／16），并有2只出现死亡（2／16），表明rFPV—ChIFNγS1对接种鸡可以产生良好的保护效果。     

乙型脑炎重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/NS+1的安全性及免疫性

用含有日本乙型脑炎病毒 (SA14 - 14 - 2株 )非结构蛋白 NS1基因的重组伪狂犬病病毒 TK- / g G- / NS 1 免疫BAL B/ c小鼠和断奶仔猪。结果表明 ,该重组病毒对 BAL B/ c小鼠和断奶仔猪是安全的 ,免疫的 BAL B/ c小鼠能抵抗伪狂犬病病毒 (PRV )强毒 (Ea株 )的致死性攻击 ,免疫的断奶仔猪能产生乙型脑炎病毒 (JEV)特异性抗体和 JEV特异性 CTL 活性。     

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。     

嵌合犬瘟热病毒H基因的重组狂犬病病毒的构建及免疫原性研究

【目的】构建表达犬瘟热病毒（CDV）血凝素蛋白H基因的重组狂犬病病毒（RABV）,并研究其生物学特性及免疫原性。【方法】在RABV HEP-dG株基因组G与L基因之间插入CDV H基因,构建重组全长cDNA质粒pHEP-dG （H）。将pHEP-dG （H）与辅助质粒共同转染BHK细胞,拯救携带CDV H基因的重组RABV HEP-dG （H）。将重组病毒接种BHK细胞,分析病毒的扩散能力;将重组病毒接种小鼠,分析病毒的致病性和免疫原性。【结果】RT-PCR及直接免疫荧光显示,传至第3代的病毒仍能检测到H基因,表明CDV H基因已成功插入RABV基因组中,并在HEP-dG （H）中稳定遗传和正确表达。HEP-dG （H）在BHK细胞中的生长曲线与HEP-dG毒株相似,病毒滴度在96 h达到峰值,但HEP-dG （H）的滴度在每个时间点略低于HEP-dG。以感染复数（MOI）为0.005感染BHK细胞,HEP-dG （H）的扩散能力比HEP-dG毒株低。HEP-dG （H）与HEP-dG对6周龄成年小鼠均不致死,但HEP-dG （H）对成年小鼠体重的影响弱于HEP-dG。HEP-dG （H）与HEP-dG均能诱导小鼠产生抗RABV的中和抗体,免疫后7 d抗体已达到保护水平（0.5 EU/mL）;此外,HEP-dG （H）可诱导产生CDV中和抗体。HEP-dG （H）与HEP-dG免疫小鼠3周后,均能抵御RABV标准攻毒毒株CVS-24的攻击。【结论】本研究成功构建重组RABV HEP-dG （H）,其具有良好的免疫原性和安全性,可作为RABV-CDV新型二联基因工程候选疫苗。     

表达非洲猪瘟病毒p54蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK_（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为10^7.34/0.1 mL和10^7.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。     

爱滋病毒抗原(P_(24))检测马传染性贫血病毒的研究

本研究通过基因工程技术生产了爱滋病毒的Ｐ２４抗原,并且运用于马传贫病毒的血清学检查,与传统方法所制备的马传贫抗原对照检测军马２５２４匹以及本实验室保留的各种马传贫阳性血清２２４份。结果显示马传贫血清能够免疫沉淀爱滋病毒（ＨＩＶ）的Ｐ２４,表明它们之间有着共同的抗原决定簇,且Ｐ２４检测法检测率高,检测周期仅３～４ｈ,明显优于传统法,可用于马传贫的快迅检测。     

BPIV-3和BVDV双重RT-PCR快速检测方法的建立

参照GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因序列,分别针对BPIV3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物,经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法。最佳扩增条件为94℃30s,56.2℃30s,72℃1min,循环30次;72℃延伸5min,16℃10min;BVDV引物浓度为1.0μmol/L,BPIV-3引物浓度为0.5μmol/L。采用该方法检测BPIV-3和BVDV参考病毒株,能同时扩增出预期为425bp和294bp大小的特异性片段,而扩增牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、致病性大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和鼠伤寒沙门菌等均呈阴性反应。对参考病毒株进行梯度稀释检测,结果证明该方法检测BPIV-3的灵敏度可达10-3 TCID50/0.1mL,而BVDV的灵敏度达102 TCID50/0.1mL。     

鸭肝炎病毒的研究进展

鸭肝炎病毒是一种高致死性、高传播性的病毒性传染病病原,临床主要引起急性肝炎,主要侵害3周龄以内的雏鸭,尤以1周龄内的雏鸭为甚,病死率高达100%。20世纪以来,鸭肝炎已成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一,给养鸭业带来了巨大的经济损失。作者对鸭肝炎病毒的发生与分布、病原学、基因组学、诊断与防治等方面进行了综述。     

携带绿色荧光蛋白基因重组猫泛白细胞减少症病毒的拯救

本研究旨在构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组猫泛白细胞减少症病毒（feline panleukopenia virus,FPV）,以便更快速有效的检测中和抗体。参照GenBank中GFP基因序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得携带AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的GFP基因,并对pFPV质粒进行定点突变,从而获得AgeⅠ和Nhe Ⅰ酶切位点,然后用AgeⅠ和Nhe Ⅰ同时双酶切pFPV和GFP基因,经4 ℃过夜连接、转化,成功构建携带GFP基因的重组猫泛白细胞减少症病毒质粒pFPV-GFP,应用脂质体转染法将重组质粒pFPV-GFP导入猫肾细胞（F81）,利用GFP独特的发光机制可在荧光显微镜下对标记的重组病毒rFPV-GFP进行细胞内活体观察,利用Western blotting鉴定重组病毒rFPV-GFP中GFP的表达情况。结果显示,重组质粒pFPV-GFP转染F81细胞24 h时可观察到绿色荧光蛋白,且随着转染时间的延长观察到的绿色荧光蛋白数量增多,说明重组质粒pFPV-GFP成功转染到F81细胞中,Western blotting鉴定出GFP在重组病毒rFPV-GFP中稳定表达。本研究通过在pFPV上成功插入GFP并拯救出病毒,说明pFPV上可以插入外源基因,为其他外源基因在pFPV上的插入奠定基础,同时GFP的插入为FPV的研究提供了更加有利的研究工具,为FPV的基础研究以及中和抗体的快速检测奠定基础。     

Establishment of Double PCR Detection Method of Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) and Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)

Two pairs of primers used to respectively amplify transmissible gastroenteritis virus (TGEV) S gene and porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) M gene were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV and PEDV.The established double PCR could detect S gene of TGEV with the length of 299 bp and M gene of PEDV with the length of 437 bp.Negative results using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 10⁴ copies/μL.68 clinical samples collected from swine farm were submitted to detect TGEV and PEDV,and the result showed that the established double PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity could be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation.     

牛病毒性腹泻病毒致病机理研究进展

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是危害养牛业的重要病原之一。BVDV感染能够引起广泛的临床症状，包括牛病毒性腹泻、粘膜病、持续感染与免疫耐受、繁殖障碍、血小板减少与出血综合征等，其相应的致病机理也非常复杂。持续感染是妊娠母畜在怀孕早期通过子宫内感染非致细胞病变（NCP)型BVDV引起的，是BVDV在自然环境中维持存在的一种重要形式。当持续感染动物再次感染抗原性相似或同源的致细胞病变（CP）型病毒时就会发生粘膜病。本文将粘膜病发生过程中CP型病毒的来源机制概括为五点：①外源细胞序列的插入；②病毒基因的重排和拷贝；③外源细胞序列插入同时伴有病毒基因的复制；④缺陷干扰粒子；⑤点突变。BVDV感染导致奶牛繁殖力下降的机制可能有两条：一是造成卵母细胞的质量下降，二是使性腺类固醇激素生成机制受到破坏，导致血浆中雌二醇、黄体酮等激素紊乱。血小板减少和出血性综合征是BVDV感染引起的又一重要临床症状，其致病机理主要有两种：①BVDV进入到外周循环，使外周循环中血小板受损程度增加，病理检查表现为血小板体积平均值较正常有明显增大；②BVDV感染造成骨髓生成血小板的能力下降，病理检查表现为血小板的体积平均值较正常减少。