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相似文献
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1.
克隆布鲁菌Omp22基因,原核表达后进行生物学信息分析。根据GenBank中羊种布鲁菌M5-90株基因组PCR扩增出639bp的目的基因片段,构建克隆重组质粒pMD-20T-Omp22,转化入E.coli DH5α。测序正确后构建表达重组质粒pET-28a-Omp22,转化入E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导表达,Western blot鉴定诱导融合蛋白。结果表明,成功克隆Omp22基因,构建pET-28a-Omp22原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达Omp22基因。DNA Man和BIOEDIT软件生物性息学分析Omp22融合蛋白二级结构中α-螺旋占22.17%;伸展链占19.81%;β-折叠占2.83%;无规卷曲占55.19%。说明该蛋白具有较高亲水性。  相似文献   

2.
为了获得具有免疫活性的猪流行性病毒S蛋白,试验参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株S基因序列设计1对特异性引物,去除信号肽,以PEDV CH/ZJ株为模板,通过RT-PCR扩增出目的基因,克隆入原核表达栽体pET28a(+),转化到Top10感受态细胞中,测序并分析.结果表明:目的基因含有1个长966 bp、编码322个氨基酸残基组成的多肽;与CV777株相比较,同源性为96.0%,但在398 bp处缺失编码1个异亮氨酸的密码子,将重组质粒命名为pET-P-SP1;将pET-P-SP1转化到大肠杆菌E.coli BL21-DL3(Rosetta)中,在1PTG诱导下表达;通过SDS-PAGE表达出与预期大小相符的约35.6 ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;表达产物占菌体蛋白的80%;表达蛋白能与抗猪流行性腹泻病毒高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫活性.  相似文献   

3.
堆型艾美耳球虫单链抗体-PE40重组免疫毒素的构建   总被引:1,自引:0,他引:1  
用HindⅢ对已构建的质粒pT-PE40和原核表达载体pET22-ScFv进行单酶切,回收纯化1 101 bp的PE40基因片段并将其亚克隆至pET22-ScFv载体中,构建重组免疫毒素表达质粒pET22-ScFv-PE40。将该质粒转化入感受态大肠杆菌J M109中增殖,提取质粒后用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定,得到了1 114 bp和6 181 bp目的基因片段。测序鉴定PE40的插入方向,选取以PE40基因5′端与ScFv基因3′端连接的重组质粒,构建了抗堆型艾美耳球虫重组免疫毒素质粒pET22-ScFv-PE40。抗堆型艾美耳球虫重组质粒pET22-ScFv-PE40经1 mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌中表达约68 000的目的蛋白。使用抗PE多克隆抗体对目的蛋白进行蛋白印迹分析,结果表达产物与抗PE多克隆抗体发生抗原抗体反应,证明融合基因得到表达。  相似文献   

4.
为了获得具有免疫活性的猪流行性病毒S蛋白,试验参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株S基因序列设计1对特异性引物,去除信号肽,以PEDVCH/ZJ株为模板,通过RT-PCR扩增出目的基因,克隆入原核表达载体pET28a(+),转化到Top10感受态细胞中,测序并分析。结果表明:目的基因含有1个长966bp、编码322个氨基酸残基组成的多肽;与CV777株相比较,同源性为96.0%,但在398bp处缺失编码1个异亮氨酸的密码子,将重组质粒命名为pET-P-SP1;将pET-P-SP1转化到大肠杆菌E.coliBL21-DL3(Rosetta)中,在IPTG诱导下表达;通过SDS-PAGE表达出与预期大小相符的约35.6ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;表达产物占菌体蛋白的80%;表达蛋白能与抗猪流行性腹泻病毒高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫活性。  相似文献   

5.
为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase,Pgk)基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因(AE009948)核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体Pgk-pET30a(+),再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2+亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。  相似文献   

6.
从水貂基因组中通过PCR的方法克隆得到干扰素α基因(IFN-α),将IFN-β成熟肽插入原核表达载体pET32a,在E.coliBL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白。结果表明IFN-β片段长564 bp,与已报道的水貂干扰素-α基因相比同源性98%。IFN-α成熟肽可编码166个氨基酸。重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子量约为36 ku,与预期结果相符。  相似文献   

7.
根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a( )上,得到含VP1大片段的pET32a( )重组子,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合.CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础.  相似文献   

8.
根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(FnBA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了1 735 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-FnBA.以HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-T-FnBA和pET28a(+),将纯化的基因FnBA亚克隆至pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET28a-FnBA,并将其转化至E.coli BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约85 000处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带.又经Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性.  相似文献   

9.
以原构建的克隆载体为模板,PCR扩增梅花鹿FSHα亚基基因,TA克隆后经双酶切插入表达载体pGEX-6P-2,阳性克隆导入E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-FSHα融合蛋白,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果表明,FSHαPCR产物大小约380bp,测序结果与GenBank序列一致;重组表达载体pGEX-6P-2-FSHα构建成功;融合蛋白经SDS-PAGE分析,结果发现,在分子质量39.3ku处出现特异性蛋白质条带,说明梅花鹿FSHα亚基基因片段已在E.coli BL21中成功表达了FSHα-GST融合蛋白。  相似文献   

10.
本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET28a—MIF,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99.5%;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET(28a)-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。  相似文献   

11.
This experiment was conducted to clone and express L1 gene of bovine papillomavirus genotype 13 (BPV13).Specific primers were designed according to the published sequences of BPV13, and 1 494 bp L1 gene fragment was amplified by PCR.After digestion by BamHⅠand Hind Ⅲ, the fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET28a(+) to construct the recombinant plasmid pET28a-L1.The recombinant plasmid pET28a-L1 was identified by double enzyme digestion and nucleotide sequencing, and was transformed into E.coli BL21(DE3).The expression of pET28a-L1 was induced by IPTG after selecting the best concentration and time.The results showed that L1 gene was exactly inserted into the prokaryotic expression vector pET28a(+), after induction, the target protein containing His-tag was successfully expressed by expression bacteria which included recombinant plasmid pET28a-L1;SDS-PAGE result showed that the molecular mass of the protein was 60 ku which was consistent with the expected size;After ultrasonic treatment, SDS-PAGE result showed that the protein existed in the precipitation;The target protein was a fusion protein with His-tag verified by Western blotting.This study laid a solid foundation for the research of function of BPV13 L1 gene and the development of effective DNA vaccine of BPV13.  相似文献   

12.
犬细小病毒VP2抗体竞争ELISA检测方法的初步建立   总被引:3,自引:3,他引:0  
本研究旨在制备犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2抗体,并建立竞争ELISA检测方法,从而为CPV疫苗免疫效果的检测及血清学调查提供技术支持。参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计1对添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的引物,PCR扩增VP2基因全长序列,将其克隆到pET28a(+)载体中,构建原核表达载体pET28a-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,目的蛋白分子质量大小为67 ku,可被CPV抗血清识别,证明其能与特异性抗体结合,有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白免疫家兔制备VP2多抗,采用辣根过氧化物酶进行标记,初步建立了竞争ELISA方法。结果显示,VP2重组蛋白的最佳包被浓度为5 μg/mL,酶标多抗的最佳稀释度为1∶3200,封闭条件为4 ℃过夜,最适的封闭液为10%小牛血清,山羊抗兔IgG-HRP的最佳工作浓度为1∶5000,显色时间为25 min。竞争ELISA试验结果表明,该方法具有较强的稳定性,有望为CPV疫苗免疫效果的判定及血清学调查提供技术手段。  相似文献   

13.
猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达   总被引:9,自引:0,他引:9  
利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段,将PCR产物克隆至pMD18-T载体,利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较,同源性均在99%以上,从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2;将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带,而其它几种质粒均未看到特异性表达带,推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。  相似文献   

14.
将中国流行株I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)B亚型gag基因和env基因定向插入原核表达载体pET28a和pET28c,获得重组表达质粒pETG、pETM1、pETM2、pETM3。将pETG转化表达宿主菌BL21(DE3)plysS,用IPTG,诱导,SDS-PAGE电泳分析有重组蛋白表达。该蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加,4h达到最大值。凝胶扫描结果显示,该蛋白表达量占菌体总蛋白的10.3%。Westrn blotting检测,该重组蛋白可与中国流行株HIV-1B亚型阳性血清发生特异反应。重组表达质粒pETM1、pETM2和pETM3仅在蛋白印迹中与gp120单抗发生特异性反应而出现特异显色带,SDS-PAGE电泳分析未见表达蛋白带。  相似文献   

15.
以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸.将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应.根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础.  相似文献   

16.
猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达   总被引:14,自引:0,他引:14  
通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,克隆到T载体pUCm-T后,序列测定表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp,编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白,免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。  相似文献   

17.
Based on the published mRNA sequence of Gallus gallus gonadotropin releasing hormone 1 (GnRH1) gene, a pair of primers was designed to clone the GnRH1 gene coding sequence of Jinghai Yellow chicken by RT-PCR. GnRH1 gene was cloned in to pET32a vector for expression in E.coil BL21 and bioinformatics analysis. Finally, a 352 bp gene was cloned, which contained CDS region, promoter region and part of the 3′region. It was found that the GnRH1 gene nucleotide sequence shared 93%, 81%, 54%, 58%, 61%, 76%, 76%, 59%, 76% and 66% identities with Meleagris gallopavo, Columba livia, Homo sapiens, Bos taurus, Babirussa, Capra hircus, Ovis aries, Pantholops hodgsonii, Equus caballus and Rattus norvegicus, respectively. Restriction and sequencing analysis confirmed that prokaryotic expression vector pET32a-GnRH1 was successfully constructed. SDS-PAGE analysis showed that the recombinant plasmid was successfully expressed in E.coli BL21 and the molecular weight was approximate 25 to 28 ku. The expression quantity in supernatant was higher than that in the precipitant. Western blotting analysis confirmed that the protein expressed in E.coli BL21 was the interest protein and expressed in soluble form with high activity. The results showed that GnRH1 gene of Jinghai Yellow chicken was cloned and GnRH1 prokaryotic expression system was constructed successfully. The interest protein was expressed successfully, which laid the foundation for further studies.  相似文献   

18.
【目的】 探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)截短M蛋白的序列结构特征与原核表达情况。【方法】 根据已公布的PEDV M基因序列设计1对特异性引物,以从阳性病料提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增并克隆PEDV截短的M基因(rM),应用在线生物信息学软件预测rM蛋白的结构特征。将得到的截短的M基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a-rM,将鉴定正确的pET-28a-rM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功构建重组菌株BL21(pET-28a-rM),并对重组菌株进行IPTG诱导表达,优化重组蛋白的表达条件,重组蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE及Western blotting检测,同时应用重组蛋白制备兔抗rM多克隆抗体。【结果】 试验克隆得到大小为366 bp的截短的M基因,重组蛋白由121个氨基酸组成,预测蛋白分子质量大小约为12.8 ku。该蛋白的二级结构由无规则卷曲、延伸链、β-转角和α-螺旋组成,占比分别为48.76%、33.88%、9.09%和8.26%。该蛋白不含信号肽,但有跨膜区,包含21个磷酸化位点。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白大小约为15 ku,以包涵体蛋白形式存在,在37 ℃、1 mmol/L IPTG诱导12 h时蛋白的表达量最高。Western blotting检测结果表明,重组蛋白与PEDV阳性血清具有较好的反应原性,纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的高免血清效价高于1∶51 200。【结论】 本研究成功克隆PEDV 截短的M基因,对rM蛋白进行了生物信息学分析,获得了高纯度的rM蛋白,为猪流行性腹泻治疗及检测用生物制品的开发奠定了基础。  相似文献   

19.
为利用大肠杆菌表达系统高效表达抗菌肽Thanatin并避免其抗菌活性对宿主菌的影响,将抗菌肽Thanatin基因与家蚕核型多角体病毒多角体蛋白Polyhedrin基因融合克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-Thanatin-polyhedrin,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE检测显示经诱导表达的菌体中有与融合蛋白理论值(35 kD)相符的目的条带。凝胶扫描分析目的融合蛋白以包涵体的形式表达,且诱导后6 h融合蛋白的表达量最大,约占菌体总蛋白量的30%。纯化融合蛋白用盐酸羟胺切割后初步纯化获得具有抗菌活性的Thanatin蛋白。研究结果表明家蚕核型多角体病毒多角体蛋白能够作为抗菌肽Thanatin融合标签介导其高水平表达,有助于利用基因工程技术大规模生产抗菌肽Thanatin。  相似文献   

20.
本试验旨在分析猪瘟病毒E2蛋白的免疫反应,应用RT-PCR方法扩增了编码猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株C株囊膜糖蛋白E2基因主要编码区,并定向克隆到表达载体pET-30a-c(+)中,获得重组表达载体pET30a-E2,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blottin分析结果表明,E2基因获得高效融合表达,且具有免疫反应活性。本试验为建立E2抗原的检测试剂盒奠定基础。  相似文献   

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