猪细小病毒(PPV)SC1株非结构蛋白NS_1基因的克隆和序列分析

本文根据GenBank中PPV NADL-2株病毒基因组序列用Oligo6.0设计了一对引物,以抽提的PPV-SC1 RF-DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.2 kb的片段,将其插入克隆载体质粒pMD 18-T的EcoRV酶切位点处,构建了重组质粒pPNS1并测序。密码子偏向性分析结果表明PPV-SC1 NS1基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,主要是以A结尾的密码子;用Bioedit和swiss TMPRED软件预测PPV-SC1 NS1的跨膜区,并没有得到有显著意义的跨膜区的存在;根据基于motif数据库的结构域预测,PPV-SC1 NS1的第393~415位氨基酸残基存在潜在的ATP/GTP结合位点,该蛋白还存在16个蛋白激酶磷酸化位点,21个酪蛋白激酶2磷酸化位点,3个cAMP-/cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点,PPV-SC1 NS1蛋白与POX-D5(痘病毒D5蛋白)具有一致的保守结构域,推测NS1可能与POX-D5有类似的功能。     

猪细小病毒(PPV)SC1株非结构蛋白NS1基因的克隆和序列分析

本文根据GenBank中PPV NADL-2株病毒基因组序列用Oligo6.0设计了一对引物,以抽提的PPV-SC1 RF-DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.2kb的片段,将其插入克隆载体质粒pMD 18-T的EcoRV酶切位点处,构建了重组质粒pPNS1并测序.密码子偏向性分析结果表明PPV-SC1 NS1基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,主要是以A结尾的密码子;用Bioedit和swiss TMPRED软件预测PPV-SC1 NS1的跨膜区,并没有得到有显著意义的跨膜区的存在;根据基于motif数据库的结构域预测,PPV-SC1 NS1的第393～415位氨基酸残基存在潜在的ATP/GTP结合位点,该蛋白还存在16个蛋白激酶磷酸化位点,21个酪蛋白激酶2磷酸化位点,3个cAMP-/cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点,PPV-SC1 NS1蛋白与POX-D5(痘病毒D5蛋白)具有一致的保守结构域,推测NS1可能与POX-D5有类似的功能.     

猪轮状病毒贵州株VP7基因克隆及生物信息学分析

为了解贵州省猪轮状病毒(PoRV)VP7蛋白的结构及功能,根据Gen Bank发表的猪轮状病毒VP7基因序列设计1对特异性引物,扩增1株猪轮状病毒贵州流行株VP7基因全序列并进行序列测定及生物信息学分析。结果显示:VP7基因全长为1 062 bp,包含一个981 bp的开放发阅读框,编码326个氨基酸,氨基酸突变主要发生在高变区。与已知的14个国内外参考毒株VP7核苷酸和推导的氨基酸序列比较,同源性分别为71.5%~97.0%和72.4%~98.7%,与G4型毒株核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为86.6%~97.0%和92.9%~98.7%。核苷酸系统进化树结果显示,贵州流行株与G4型毒株CMP070/09属同一个分支,因此推测贵州流行株为G4型猪轮状病毒。预测PoRV VP7蛋白理论相对分子质量为37.2 ku,等电点为4.75,半衰期为30 h,不稳定系数为31.22;跨膜结构及信号肽分析表明VP7蛋白有2个跨膜区,无信号肽区域;抗原表位预测显示VP7蛋白在第69~104、145~150、176~183、210~224、311~321位及其附近肽段可能为其优势抗原表位;结构预测显示,VP7蛋白存在1个N-糖基化作用位点、14个磷酸化位点,不存在O-糖基化位点。     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0 kb的基因片段,将PCR产物克隆至pMD18-T载体,利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列.将所得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较,同源性均在99%以上,从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性.将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2;将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8 kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f.利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现pET17bVP2f质粒在45 kD处有一特异性表达带,而其它几种质粒均未看到特异性表达带,推测VP2基因3′端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响.这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义.     

猫细小病毒VP2基因克隆与生物信息学分析

为了解猫细小病毒（feline parvovirus,FPV）VP2蛋白的分子特点及变异规律,克隆FPV山东分离株SD-01的VP2基因,对其进行生物信息学分析。首先,以FPV阳性病料基因组DNA为模板,PCR扩增VP2基因并克隆获得重组质粒pMD18-T-FPV SD-01-VP2。测序结果显示：VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;氨基酸同源性比对发现,与其他FPV分离株的VP2基因氨基酸同源性较高,可达99.0%~100%。生物信息学分析结果显示：VP2蛋白为非分泌型的亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域;二级结构中α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲分别占8.7%、24.5%、4.3%和62.5%;三级结构预测发现,VP2蛋白以无规则卷曲为主,与二级结构预测结果一致。亚细胞定位预测显示,VP2蛋白不含有线粒体导肽（mTP）或分泌通道信号肽（SP）,定位在细胞质和细胞核中的概率较高,分别为47.8%和26.1%。B细胞抗原表位预测结果显示,VP2蛋白的抗原性及表面可及性较高,共含有11个潜在的优势B细胞抗原表位。蛋白翻译后修饰预测结果显示,VP2蛋白可能含有49个潜在磷酸化修饰位点,6个N-糖基化修饰位点和21个O-糖基化修饰位点,且这些修饰位点在FPV VP2蛋白内高度保守。本研究有助于了解我国FPV流行情况,掌握其重要结构蛋白VP2的理化性质和特性,从而为下一步VP2蛋白功能研究和疫苗研发奠定了基础。     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPV FM株和GPV B株全基因序列,设计并合成一对引物,分别对MDPV GD株和GPV GD株的结构蛋白基因(VP1)进行PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体,筛选到重组质粒并测序.通过对MDPV GD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析,这两种病毒VP1基因大小均为2 199 bp,核苷酸序列同源性为87%,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大,同源性仅为64%.另外对MDPV GD株和GPV GD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较,显示它们之间差异较小.     

猪博卡病毒VP2基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪博卡病毒VP2蛋白的结构与功能,应用套式PCR技术对猪博卡病毒VP2基因进行分子克隆,并对其进行生物信息学分析。结果显示,获得了1 656bp的猪博卡病毒VP2基因(GenBank登录号为KF806730),此序列与其他PBoV分离株核苷酸序列同源性为82%⁸9%,进化树分析结果显示,KF806730与PBoV5在一个分支,说明两者之间具有较近的亲缘关系。经生物信息学分析,此序列编码551个氨基酸,相对分子质量为61 261.7,理论等电点(PI)为5.98,体外半衰期为30h(体外哺乳动物类网状细胞),不稳定系数为34.36,脂肪系数为54.88,平均亲水性为-0.766,最大疏水指数为1.733,最小疏水指数为-3.378;在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定程度的偏向性;无信号肽和跨膜区;综合多种方法分析预测其主要抗原表位可能位于第78-80aa、311-314aa、507-509aa区域;二级结构、三维结构预测显示VP2蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个螺旋和折叠区域。本试验成功获得猪博卡病毒VP2基因,为以后研究此基因的生物学功能和建立该病毒的诊断方法奠定了基础。     

大熊猫轮状病毒CH-1株外衣壳蛋白(VP7)基因的克隆和生物信息学分析

为研究大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)CH-1株外衣壳蛋白VP7基因的结构及功能,用MA-104细胞(恒河猴胎猴肾细胞)增殖GPRV,提取总RNA,运用RT-PCR扩增VP7基因,并测序,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示成功获得了长1042bp的GPRV VP7蛋白基因(GenBank登录号GU188284)。经生物信息学分析,此序列包含1个981bp的完整开放阅读框,编码326个氨基酸;预测GPRV VP7蛋白理论相对分子质量为37354.8u,等电点为4.76,半衰期为30h,不稳定系数为26.71,总平均亲水性为-0.015,疏水性介于-2.344～3.567;1—24位氨基酸可能是信号肽序列;跨膜结构分析表明VP7蛋白有2个跨膜区,其N端和C端都位于病毒膜外区;抗原表位预测显示VP7蛋白有12个抗原决定簇;结构预测显示其可能包含2个N-糖基化作用位点,5个蛋白激酶C磷酸化作用位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点、4个N-豆蔻酰化位点、1个原核膜脂蛋白脂附着点和1个革兰氏阳性球菌表面蛋白‘锚’六肽。系统进化树分析显示GPRV VP7基因与人A组轮状病毒VP7基因的进化距离最近。本研究成功获得了GPRV VP7基因,为今后研究此基因的生物学功能以及建立该病毒的诊断方法奠定基础。     

番鸭细小病毒强毒株(MDPV-Q)VP_2基因的序列分析

应用PCR技术扩增了MDPV_Q株的VP2 蛋白基因片段。将扩增后的VP2 基因重组到pMD18_T质粒载体上 ,并对插入片段进行序列测定。将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列分别与MDPV、GPV进行了同源性比较及分析。结果表明 ,我国分离的MDPV_Q株其VP2 基因序列与国外分离株具有很高的同源性。而与GPV的同源性较低。     

传染性法氏囊病病毒VP2-4-3 cDNA的分子克隆和序列分析

从法氏囊组织分离IBDV超强毒株HK46并提取基因组RNA。以RNA为模板进行反转录合成cDNA第一链。采用长PCR扩增技术获得VP2－4－3 cDNA全长片段。将PCR产物克隆到pcDNA3.1( )载体，得到重组质粒pPP1。对pPP1插入片段全长序列进行了测序并对其序列进行了分析。结果表明，VP2－4－3 cDNA阅读框架由3039bp组成，可编码1012个氨基酸组成的前体多聚蛋白。经比较得知，HK46超强毒株VP2－4－3氨基酸序列与经典毒株间存在19－28个氨基酸的差异；与Harbin强毒株相差32个氨基酸；而与超强毒株OKYM和UK661分别相差2和6个氨基酸，且它们的VP2序列完全相同。在HK46超强毒株所特有的9个氨基酸中，3个位于VP2可变区，显示超强毒株其抗原性存在着变异。     

新型鸭肝炎病毒分离株JFX08全基因组测定与分析

对我国鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)分离株JFX08的全基因组进行了序列测定与分析。结果表明,JFX08毒株的基因组全长为7793nt,包括652nt的5’UTR,6753nt的ORF,366nt的3’UTR以及19nt的poly(A)尾巴。JFX08毒株的ORF编码2251个氨基酸,各基因均与韩国新型毒株的氨基酸序列相似性最高,与1型DHV和台湾新型DHV的序列相似性均较低。其中VP1较1型DHV存在2个氨基酸的插入和较多氨基酸位点的突变,高变区主要集中在180～194位和213～219位。JFX08毒株的非编码区核苷酸序列之间存在大量碱基突变和插入/缺失。多聚蛋白、VP0、VP3、VP1、2C和3D基因进化分析结果均表明,JFX08分离株与韩国新型DHV的遗传距离最近,属基因C型。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因，将其插入pMDl8-T载体进行序列分析，结果表明，所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物，以重组pMD-T—VP1阳性质粒为模板，扩增获得了VP1基因，通过酶切将其克隆至表达载体pQE—Trisystem上。经测序证实，重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE—VP1转化至大肠埃希氏菌M15，通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达，SDS—PAGE和Western—blot分析表明，表达产物大小与预期的结果（26ku）一致，且具有良好的反应原性。以2mmol／LIPTG诱导表达5h时表达量最高，其中70％～80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中，表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

犬TfR胞外区密码子的优化、真核表达及与犬细小病毒VP2蛋白结合

为制备大量具有天然活性的犬胞外区可溶性转铁蛋白受体(sTfR),本试验通过密码子优化提高sTfR在真核细胞中的表达水平.利用RT-PCR方法从犬肝脏中扩增sTfR编码基因,依据该基因编码的氨基酸序列,参照人偏爱的密码子,对该基因进行密码子优化并由公司合成.利用peDNA3.1-CD5质粒分别构建野生型和密码子优化的sTfR基因真核表达载体,经磷酸钙介导使其在HEK293T细胞中进行表达,利用Western-blotting鉴定表达产物,通过ELISA检测重组犬sTfR蛋白与犬细小病毒VP2蛋白的结合活性.结果显示本试验扩增的犬sTfR基因与GenBank该基因序列的同源性为100%;通过在HEK 293T细胞中进行瞬时表达,结果显示密码子优化可以明显提高sTfR基因在HEK 293T细胞中的表达水平,提高了75%.同时表达的sTfR蛋白能够与犬细小病毒VP2蛋白进行特异结合,表明表达的重组sTfR蛋白具有天然活性.     

传染性法氏囊病病毒C4毒株VP2基因的原核表达及生物信息学分析

试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒（IBDV）河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a（+）原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV（vvIBDV）分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-A-S-G-S（第326-332位氨基酸）符合超强毒株特征,且222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201（D/G）、281（G/R）、313（V/A）位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279-290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a（+）-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67 ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201（G）、281（R）、313（A）位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。     

Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of VP2 Gene of Infectious Bursal Disease Virus C4 Strain

This study was aimed to investigate the relationship between the virulence characteristics of infectious bursal disease virus(IBDV) C4 strain and its VP2 amino acid sequence. The RNA of IBDV C4 strain was extracted,and its VP2 gene was amplified by RT-PCR.VP2 nucleotide sequences and deduced amino acids of different virulent IBDV strains were compared. At the same time, prokaryotic expression vector pET-32a(+) was used to express the VP2 gene. The expression of recombinant VP2 protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting. The results showed that the VP2 gene of IBDV C4 strain belonged to the very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) in evolutionary relationship, the VP2 nucleotides homology between IBDV C4 strain and other vvIBDV strains were 98.1% to 98.7%, and there were no mutations in S-W-S-A-S-G-S (326-332 amino acids) and 222(A), 256(I), 294(I) and 299(S). The VP2 amino acid sequence of IBDV C4 strain was consistent with the characteristics of other vvIBDV strains. However, there were three differences amino acids sites at 201(D/G), 281(G/R) and 313(V/A) between the amino acids of the C4 strain and the very virulent strain UK661. And the change of 281(R) was in the small hydrophilic region of 279 to 290, which was related to the antigenicity of the virus; The recombinant VP2 protein molecular weight expressed in Escherichia coli BL21 was about 67 ku. This study provided a basis for further research on antigenic changes resulting from amino acid variation of 201(G), 281 (R) and 313(A). These results indicated that the VP2 gene of the IBDV C4 strain was consistent with the major characteristics of the vvIBDV strain VP2 gene. The difference of three amino acid sites in the vvIBDV strain C4 might be related to the evolution of virulence of IBDV strain in China.     

鹅细小病毒SS/10株的分离鉴定及生物学特性研究

2010年从佛山市某专业户送检的雏鹅肝组织中分离到1株鹅细小病毒(命名为SS/10株),并对其生物学特性进行了研究。该毒株的番鸭胚半数致死量为10^-4.6/0.3 mL,动物回归试验显示其对10日龄雏鹅没有致死性,从组织切片观察肠、肝脏、肾脏和脑组织均有明显的病理变化。对该毒株测序分析结果发现,其VP1、VP2和VP3基因与GenBank收录的番鸭分离株DY株的同源性较其他参考毒株(鹅分离株)的同源性低,NS1和NS2基因的同源性没有这种差异;其VP3基因与82-0321V,VG32/1和标准株B株在同一分支上,与82-0321V亲缘关系最近,与番鸭细小病毒GD株亲缘关系最远;其VP3基因与B株相比少了505-507位的糖基化位点NRT。     

广西梧州地区近十年传染性法氏囊病病毒vVP2变化特征分析

为了解近10年来广西梧州地区鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)分子进化情况,对2013年—2014年间来自该地区传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)的法氏囊样品进行IBDV的分离鉴定,并对分离株以及课题组2006年—2013年间分离的毒株,共24株的VP2高变区(vVP2)进行序列分析和遗传进化分析。结果表明,QX0601等23个分离株在关键氨基酸位点上具有256I、284A、294I等超强毒株(vvIBDV)的分子特征,遗传进化分析表明,这23株分离株与UK661、HK46等超强毒参考株同处一个分支中,亲缘关系较近;QX110603在关键性氨基酸位点上则具有256V、284T、294L等弱毒株的特征,遗传进化分析显示,其与BJ836等致弱株处于同一分支,亲缘关系较近。对所有分离株进行氨基酸位点分析发现,该地区IBDV进化出现了新的特点,212D-212N符合国内近年来的分离株的变化趋势,209T-209A、338R-338H、359T-359R则表现出地域特点,未曾见过相似报道。研究结果表明,具有vvIBDV分子特征的分离株是该地区近10年来主要流行毒株,该地区IBDV毒株在vVP2序列上仍处于不断进化中,且带有地域特点。     

蒺藜苜蓿叶绿体密码子偏好性分析

本文对蒺藜苜蓿叶绿体基因组全序列密码子进行分析,筛选出50条CDS(coding DNA sequence)利用CodonW软件进行分析其密码子使用模式。结果显示,蒺藜苜蓿叶绿体基因组密码子第3位碱基GC含量为26.9%,即第3位密码子富含A和U,ENC值在37.11~51.91之间密码子偏好性较弱。相对同义密码子使用度分析显示RSCU值大于1的密码子有23个,其中以A和U为结尾20个。中性绘图分析显示GC₁₂与GC₃的相关系数为0.341,相关性不显著,回归系数为0.4843;单基因ENC比值多分布在-0.05~0.05,即大部分基因ENC值离ENC期望值较近;对应性分析,第一轴显示了12.50%的差异为主要影响因素,第一轴与ENC和GC₃的相关系数分别为0.091和-0.092,均相关不显著。综合这几项分析发现蒺藜苜蓿叶绿体基因组密码子偏好性主要受到突变的影响,但是并不是唯一的影响因素,其他因素对密码子偏好性也可能有一定的影响。最终通过高表达优越密码子方法确定得出UUA、UUG、CCU等23个密码子为最优密码子,为之后对外源基因进行改造,提高其在叶绿体中的表达效率奠定了基础。