鱼病毒性出血性败血症的诊断和防治

<正>1病原体随着鱼类组织培养方法的发展,病毒性出血性败血症(VHS)的病原已被确认为病毒。病毒粒子大约长为180nm(毫微米),直径为60～70nm。保存在50%的甘油中数天后丧失感染力。分离病毒最好用     

鱼病毒性出血性败血症的诊断和防治

<正>1病原体随着鱼类组织培养方法的发展,病毒性出血性败血症(VHS)的病原已被确认为病毒。病毒粒子大约长为180nm(毫微米),直径为60～70nm。保存在50%的甘油中数天后丧失感染力。分离病毒最好用     

病毒性出血性败血症病毒夹心ELISA检测方法的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的夹心ELISA方法,本研究以VHSV单克隆抗体(MAb)IP5B11为捕捉抗体,兔抗VHSV多抗为检测抗体,经反应条件优化建立了VHSV夹心ELISA检测方法。结果表明,该方法与几种常见鱼病病毒无交叉反应,具有较好的特异性;该方法组内和组间变异系数平均值分别为0.046和0.064,重复性良好。采用夹心ELISA和RT-PCR同时检测添加VHSV病毒悬液的40份鳗鱼组织匀浆和未添加病毒的40份阴性对照鳗鱼以及5份星斑川鲽模拟组织样品,结果两种方法检测符合率为100%。本研究建立的夹心ELISA方法可以用于出入境鱼类疫病的检测和国内养殖场的疫情监控。     

病毒性出血性败血症病毒焦磷酸测序检测技术的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)焦磷酸测序检测技术,本研究通过对VHSV靶基因特异性序列的同源性分析,设计出适合焦磷酸测序特异性扩增和测序的引物,对焦磷酸测序反应体系和反应程序进行优化,建立了VHSV焦磷酸测序检测方法。结果表明,该方法仅对目的病毒基因扩增,而对其它病毒检测为阴性,表明该方法特异性好;该方法最低检出核酸量为82拷贝/μL,灵敏度高。选取国内采集与进口的鱼类样本共计1924批次进行VHSV检测,结果显示,焦磷酸测序检测方法检测结果与常规RT-PCR一致,该方法的特异性和灵敏度可以满足水生动物疫病检测的需要。     

病毒性出血性败血症病毒液相芯片检测技术的建立

为建立检测病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中VHSV的G基因进行序列分析,设计VHSV特异性引物并标记生物素。探针氨基化修饰并与荧光编码微球偶联后与VHSV RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。结果表明液相芯片检测体系能够正确检出VHSV。病毒核酸的最低检出量为10pg,检测特异性高,说明初步建立了检测VHSV的液相芯片技术,为VHSV的检测提供了新方法。     

病毒性出血性败血症病毒N基因的病毒样颗粒制备及定值

为制备含有病毒性出血性败血症病毒(VHSV)N基因的RNA病毒样颗粒标准样品,通过RT-RCR扩增VHSV的N基因,将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS_2his载体中,构建重组原核表达载体pNHMS_2his-N;将重组质粒pNH-MS_2his-N转化至表达菌株BL21(DE3),用1 mmol/L IPTG诱导表达、纯化;对病毒样颗粒进行鉴定及稳定性试验,使用数字PCR对病毒样颗粒进行定值。结果显示,该病毒样颗粒含VHSV N基因序列,并且稳定性良好,定值结果为8×10~6 copies/m L。结果表明,构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。     

罗非鱼湖病毒病传入风险分析

为评估罗非鱼湖病毒（tilapia lake virus,TiLV）跨境传入风险,按照OIE传入风险评估框架,从危害识别、风险评估及风险管理3个方面,开展了TiLV跨境传入风险分析,并提出了相应的风险控制措施。分析认为：活的敏感鱼类（包括亲鱼、鱼卵和鱼苗）,用做鲜活饵料的鱼类（野杂鱼）及冰冻和冰鲜的敏感鱼类（包括去除内脏的鱼肉）TiLV传入风险较高,而敏感鱼加工类产品、非敏感鱼类（包括活的和其他形式的产品）及运输活鱼的水、包装、运输工具和用具等传入风险较低。建议不从疫区进口高风险产品,对于低风险产品可以自由贸易,而对运输活鱼的水、包装、运输工具和用具等要进行强制常规消毒。     

荧光环介导逆转录等温扩增（RT-LAMP）技术在病毒性出血性败血症（VHS）诊断中的应用

运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统,以LAMP法荧光检测为基础,建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法.根据对VHSV病毒N基因序列的分析,针对病毒的高保守区域的6个特异性序列,设计了3对特异性引物,同时加入dsDNA混合染料,对核酸扩增过程进行实时荧光监控.该方法的特异性良好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应.敏感度高,检测限为20 fg RNA模板.实验结果表明该方法是一种操作简单、快速高效、高特异性高灵敏度的病毒检测方法.     

3种鱼类弹状病毒荧光定量环介导等温扩增检测方法的建立

鲤春病毒血症病毒(SVCV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)是严重危害水产养殖业的3种鱼类弹状病毒。为建立这3种鱼类弹状病毒的快速检测方法,本研究设计合成针对这3种病毒系列引物,并在扩增反应体系中加入荧光染料SYBR Green I,通过恒温荧光检测仪Deaou-308C扩增检测,分别建立了这3种病毒的荧光定量环介导等温RNA扩增(RT-LAMP)方法。经反应条件的优化,检测结果显示,这3种方法分别对SVCV、VHSV和IHNV 3种弹状病毒具有特异性的扩增反应,对传染性胰坏死病毒、狗鱼弹状病毒和牙鲆弹状病毒核酸的扩增结果均为阴性,具有良好的特异性。灵敏度试验最低检测限分别为4.0×104拷贝/μL、5.4×104拷贝/μL、4.3×104拷贝/μL。该方法在63℃下保温40 min可以完成检测,操作简单、灵敏度高、特异性强,通过恒温实时荧光检测仪可实时检测及自动判读检测结果,适合现场检测和口岸快速检测。     

鱼类病毒性出血性败血症病毒诊断胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以标记纯化的VHSV G蛋白单克隆抗体(MAb)10A7为捕捉抗体,将纯化的抗VHSV N蛋白的MAb 10EN单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带,经试验条件优化,组装形成胶体金免疫层析试纸条。用本试验研制的胶体金试纸条检测VHSV感染的CHSE细胞培养物。结果显示:在检测线和质控线均呈现红色条带,而健康的CHSE细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的病毒量最低限为10~(4.0) TCID_(50);随机挑取3个不同批次的试纸条,对阳性样品和阴性样品进行重复试验,未发现差异。特异性试验表明,该试纸条与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)无交叉反应。将同一批次的试纸条在4℃条件下保存不同时间后进行检测,发现保存6个月的试纸条仍具有良好的稳定性。本试验研发的胶体金诊断试纸条具有良好的特异性、灵敏性和重复性,在快速辅助检测方面具有推广应用价值。