日本结缕草ZjERF1的克隆、转录激活活性、亚细胞定位及表达分析

ERF转录因子是植物体内最大的一类转录因子之一,在调控植物生长发育和响应环境胁迫等方面发挥着重要的作用。研究利用RACE技术,从日本结缕草中克隆到ZjERF1基因(GenBank登录号为MH294481),开放阅读框为630 bp,编码209个氨基酸残基,含有1个高度保守的AP2结构域,属于典型的ERF转录因子。利用染色体步移技术,成功获得ATG上游1581 bp的启动子序列,生物信息学分析表明其中含有多个响应MeJA等激素和非生物胁迫的作用元件。为分析其转录激活特性,构建了pGBKT7-ZjERF1载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,结果表明其具有较强的转录激活活性。为探析其亚细胞定位情况,成功构建35S::ZjERF1:YFP载体,本生烟草瞬时表达结果证明ZjERF1定位于细胞核。为进一步研究ZjERF1的表达特征,利用实时荧光定量的方法进行了验证,结果表明:ZjERF1在日本结缕草茎中表达量最高,并且与叶片的衰老程度呈正相关性;此外ZjERF1的表达可受200μmol·L^-1 ET、10μmol·L^-1 MeJA和300 mmol·L^-1 NaCl处理的诱导,但受到20%PEG4000的抑制。研究表明ZjERF1是一个可参与多种信号转导途径的优良转录因子,为进一步探索ZjERF1基因的功能及其调控机制奠定了基础。     

日本结缕草ZjNAC1的克隆、转录激活活性、亚细胞定位及表达分析

采用RACE技术从日本结缕草中克隆得到ZjNAC1转录因子(GenBank No. MH428376),其开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。ZjNAC1编码的蛋白在N端有1个典型的NAM保守结构域,属于NAC转录因子家族。通过染色体步移的方法,获得ZjNAC1基因ATG上游1635bp序列,分析发现其包含响应脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)及逆境胁迫的作用元件。构建pGBKT7-ZjNAC1载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,发现ZjNAC1具有转录激活活性。农杆菌介导的35S-ZjNAC1-YFP载体注射本生烟草叶片瞬时表达结果显示,ZjNAC1定位于细胞核。实时荧光定量结果表明,ZjNAC1在日本结缕草根中表达量最高;此外,ZjNAC1的表达受10μmol/L MeJA和20%PEG4000处理的诱导,但受200μmol/L乙烯(ET)、10μmol/L ABA和300mmol/L NaCl处理的抑制。     

日本结缕草ZjERF2基因的克隆、转录激活活性、 亚细胞定位和表达分析

采用RACE的方法,克隆了日本结缕草(Zoysia japonica)ZjERF2基因(GenBank登录号为MH479420)。其开放阅读框为825 bp,编码274个氨基酸,含有一个高度保守的AP2结构域,具有典型的ERF转录因子特征。遗传进化分析表明其与黍(Panicum hallii)ERF亲缘关系最近。利用染色体步移的方法克隆ATG上游1 549 bp的启动子序列,PLACE预测其含有多个响应激素和胁迫处理的作用元件。构建了pGBKT7-ZjERF2载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,结果表明其具有较强的转录激活活性。为探析其亚细胞定位情况,成功构建35S??ZjERF2?YFP载体,本生烟草(Nicotiana tabacum)瞬时表达结果证明ZjERF2定位于细胞核。利用实时荧光定量的方法分析了ZjERF2的表达特征,结果表明ZjERF2基因在日本结缕草不同部位及不同发育时期表达量均有差异,在成熟叶片表达量最高。此外ZjERF2表达受ET、MeJA的诱导,但受ABA、PEG和NaCl的抑制。本研究表明ZjERF2是一个参与多种信号转导途径的转录因子。     

扁蓿豆SK2型脱水素基因MrDHN3的异源表达提高大肠杆菌对盐和高温胁迫的抗性

扁蓿豆为高原高寒地区优质豆科牧草,具有极强的抗旱、耐寒、抗盐碱的能力。脱水素(DHNs)是参与植物逆境应答的一类蛋白。根据前期RNA-seq的结果,从扁蓿豆幼苗中克隆到一个编码脱水素的基因MrDHN3。序列分析显示该基因含666 bp的开放阅读框,编码221个氨基酸,为一个SK2型酸性脱水蛋白。氨基酸序列比对结果表明,MrDHN3与豆科植物白三叶和蒺藜苜蓿相似性最高,达83%。实时荧光定量PCR结果显示,MrDHN3基因受脱水、低温、高盐和脱落酸处理诱导表达,表明MrDHN3参与了扁蓿豆的非生物胁迫响应。通过构建原核表达载体,在大肠杆菌中过表达MrDHN3蛋白,检测重组菌在盐和高温胁迫处理下的生长存活情况。结果发现,在0.5 mol/L NaCl和0.5 mol/L KCl高盐胁迫条件下,重组大肠杆菌的存活率明显高于对照菌株;在55 ℃高温胁迫条件下, 转化大肠杆菌的生长状态明显优于对照。表明MrDHN3对盐和高温引起的细胞损伤具有保护作用。为今后作物抗逆性遗传改良的研究提供了有用信息。     

毛果扁蓿豆的核型分析

对毛果扁蓿豆进行的核型分析结果表明,毛果扁蓿豆为二倍体,其核型为1B,核型公式为2n=2x=16=16m.国内未见类似报道.     

扁蓿豆叶片解剖结构特征与生态因子相关性分析

为了探讨扁蓿豆(Medicago ruthenica)叶片组织结构与生境的关系,以来自我国7个省市(自治区)的扁蓿豆种质资源共59个居群的成熟叶片为试验材料,采用石蜡制片法,用光学显微技术测定叶片上表皮厚度、叶片下表皮厚度、叶片厚度、维管束直径、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅海比、叶片栅栏组织结构紧密度和叶片海绵组织结构疏松度。方差分析表明:不同地区扁蓿豆解剖结构的9个特征表现出很大程度的差异性,变异系数变化范围为7.47%~24.49%;相关分析表明:各指标之间大多都存在一定的相关关系;主成分分析表明:栅栏组织厚度、海绵组织厚度、维管束直径及叶片厚度基本可以代表大部分叶片解剖结构特征的变异信息。聚类分析把59个居群分为6大类,表现出居群之间的亲缘关系与地理分布有一定的关联;生态因子分析表明:年降水量与栅栏组织厚度、海绵组织厚度及叶片厚度成显著正相关(P<0.05),推测栅栏组织厚度、海绵组织厚度和叶片厚度的大小与扁蓿豆种质资源的抗旱特性有关。     

基于转录组测序的青藏扁蓿豆EST-SSR标记开发与验证

青藏扁蓿豆(Medicago archiducis-nicolai)广泛分布于青藏高原及其毗邻地区,对高海拔极端环境具有极强的适应性。本研究利用高通量转录组测序数据,对青藏扁蓿豆的EST-SSR标记进行了开发。结果发现,随机选取的477对引物中,350对可在青藏扁蓿豆中有效扩增,其中346对引物在扁蓿豆(M. ruthenica)中可实现跨物种扩增。利用其中64对独立遗传且符合哈迪–温伯格平衡的标记引物对青藏扁蓿豆和扁蓿豆野生群体的遗传多样性和群体遗传结构分析发现,两个物种存在明显的种间和种内的遗传分化,且提示种内群体间的遗传分化与地理隔离或环境选择有关。本研究所开发的EST-SSR标记为今后进一步评价青藏扁蓿豆和扁蓿豆的遗传多样性以及解释其适应极端环境的遗传机制提供了重要的研究工具。     

不同NaCl胁迫对苗期扁蓿豆渗透调节物质及光合生理的影响

采用盆栽法研究不同浓度NaCl(0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 mmol/L)胁迫对扁蓿豆苗期有机渗透调节物质及光合参数的影响。结果表明,相同胁迫天数下,随盐浓度的升高。扁蓿豆可溶性蛋白含量、可溶性糖含量呈降低趋势,脯氨酸含量呈升高趋势。各个观测期和浓度之间存在差异,胁迫第7 和14天,300 mmol/L浓度下可溶性蛋白含量显著低于对照(P<0.05);胁迫第7,14和21天,50~100 mmol/L浓度下,可溶性糖含量明显高于对照,但胁迫第28天,250~300 mmol/L浓度处理显著低于对照(P<0.05)。胁迫第7天,150~300 mmol/L浓度处理、胁迫第14天,200~300 mmol/L浓度处理、胁迫第21天,250~300 mmol/L浓度处理扁蓿豆脯氨酸含量均分别显著高于对照及其他处理(P<0.05)。可见,盐胁迫下,扁蓿豆产生的3 种渗透调节物质调节方式不同,盐胁迫对扁蓿豆幼苗的抑制程度与盐浓度、胁迫时间呈正比。不同的胁迫浓度和胁迫时间,扁蓿豆3 个观测期光合参数变化不尽相同。胁迫第14天,叶片净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)和胞间CO₂浓度(C_i)随盐浓度的升高呈先上升后降低的趋势。50~100 mmol/L浓度处理P_n、T_r和G_s显著高于对照,但300 mmol/L浓度处理P_n和T_r显著低于对照及其他处理(P<0.05)。胁迫第28天,4 个光合参数随盐浓度的升高而降低。叶片气孔限制值(L_s)和水分利用效率(WUE)在胁迫14 和28 d时,变化规律一致,随盐浓度的升高呈上升趋势。     

扁蓿豆研究进展

综述了扁蓿豆Medicago ruthenica研究工作进展,包括分类学地位的变化以及分布范围、遗传多样性、生物学特性、农艺学特性、育种与引种等方面的研究概况.并针对扁蓿豆研究存在的问题,提出今后研究应当集中在扁蓿豆的适应区域、抗逆基因的筛选、英果开裂问题以及进一步的建立人工草地等方面.     

高羊茅FaRVE8基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

生物钟是一个复杂的调控网络,在环境的不断变化中促进植物的生长,REVEILLE8 (RVE8)是生物钟的重要基因。为探讨其分子机理,采用RT-PCR和RACE方法,克隆高羊茅叶片FaRVE8基因,结果显示,FaRVE8全长为1881 bp,有1236 bp的开放阅读框,编码411个氨基酸,同属于MYB样因子。遗传进化树表明其与禾本科植物二穗短柄草、节节麦、大麦的同源蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量分析高羊茅叶片中FaRVE8在不同光照处理下的表达特征,结果表明,FaRVE8在不同光照处理下均有表达,且呈现出明显的昼夜节律。亚细胞定位显示FaRVE8定位在细胞核中,可能在细胞核中发挥重要作用。以上研究表明,FaRVE8在调节生物节律中有重要作用,为进一步探讨FaRVE8基因的功能和分子调控机制奠定基础。     

扁蓿豆的抗性研究进展

综述了扁蓿豆（Medicago ruthenica）抗旱性、耐盐性、抗寒性和抗病虫等四方面的研究工作进展,包括植物学特性、种子特性、物候期及根、茎、叶的生长发育、利用价值及分布和抗逆性方面的研究概况。并针对扁蓿豆研究存在的问题,提出今后研究应当集中在扁蓿豆的适应区域、抗逆基因的筛选、荚果开裂问题以及进一步的建立栽培草地等方面,以期对我国扁蓿豆种质资源的收集、保存、开发利用、新品种选育及北方生态建设提供理论依据。     

花苜蓿内生放线菌多样性及群落结构

为了了解药用植物花苜蓿内生放线菌的多样性和群落结构,将采自四川省甘孜地区的药用植物花苜蓿进行严格的表面消毒灭菌后,运用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技术对其根茎叶花等样品的内生放线菌进行分析。结果表明,花苜蓿不同组织中内生放线菌多样性和群落结构存在明显差异。其内生放线菌的多样性指数(H)和丰富度(S)均是花>根>茎>叶,而均匀度(E_H)则是叶>根>茎>花。不同组织样品之间的放线菌群落结构相似性差异明显,其中茎与叶的相似性最高,根与叶之间相似性最低,其他组织之间相似性均很低。DGGE条带回收测序结果显示,大部分克隆条带属于链霉菌属(Streptomyces),但仍有超过43%的条带属于稀有放线菌,且主条带A23和共有条带A12属于稀有放线菌,说明部分稀有放线菌在花苜蓿样品内是优势放线菌。该研究表明了花苜蓿根茎叶花组织的内生放线菌存在丰富的多样性,且不同组织内生放线菌多样性存在明显差异,其中花组织多样性最丰富。说明甘孜地区的药用植物花苜蓿可作为一种较理想的分离内生放线菌的植物资源。     

Identification of Medicago ruthenica hybrids and heterosis analysis of main agronomic traits in F1 and F2

Medicago ruthenica is a leguminous forage crop with strong resistance to various stress factors and rich genetic diversity,which can be used as a cross breeding parent within the same forage genus as a source of rich genetic resources. Identification of a procedure to obtain true hybrids is an important component of cross breeding and heterosis utilization. In this study,in order to obtain new germplasm materials of M. ruthenica with more abundant genetic characters,two hybrid combinations were made by reciprocal crosses,using M. ruthenica cv.‘Zhilixing’ with upright growth form and high yield,and a yellow-flowered variant of wild M. ruthenica var. Sojak with strong stress resistance as parents. 85 true hybrids were identified from 118 F1 hybrids by sequence-related amplified polymorphism（SRAP）molecular marker technique. F2 material was obtained from the true cross F1 plants with excellent performance of M. ruthenica‘Zhilixing’♀ ×M. ruthenica Sojak ♂,and further heterosis analysis was carried out on the main agronomic characters of 13 F1 and 20 F2 plants for traits such as plant height,plant growth form,number of primary branches,approximate leaf area,leaf∶stem ratio and single plant aboveground biomass of single plants. It was found that the coefficients of variation of phenotypic values of F1 traits ranged from 18. 82% to 45. 72%,among which the aboveground biomass per plant,leaf∶stem ratio and primary branch number varied most greatly. The parental dominance of each trait ranged from -54. 2% to 26. 9%,but only the leaf stem ratio （8. 22%）showed superparental dominance. The coefficient of variation（19. 66% to 41. 63%）of each trait in F2 was lower than that in F1,and the heterosis（-52. 38% to 19. 75%）was weakened. In addition,the mid- and super-parent vigor of yield-related traits in F1 and F2 were mostly negative and the intraspecific heterosis was weak. This study will provide new germplasm for the improvement of M. ruthenica and other forages of the Medicago genus. © 2023 Editorial Office of Acta Prataculturae Sinica. All rights reserved.     

紫花苜蓿ＷＲＫ转录因子基因的克隆与亚细胞定位

 ＷＲＫＹ 转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和ＲＴ－ＰＣＲ 结合的方法获得１个紫花苜蓿ＷＲＫＹ 转录因子家族成员的ｃＤＮＡ 序列,命名为MsWRKY56。该序列长１２６７ｂｐ,包含１个９５１ｂｐ的最大开放阅读框,编码３１７个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。     

扁蓿豆遗传多样性的研究进展

扁蓿豆（Medicago ruthenica）为二倍体豆科优良牧草,其抗逆性强、适应性广,生长于温带和寒温带。通过对扁蓿豆在表型、染色体、蛋白质及DNA水平的遗传多样性的研究进展,表明扁蓿豆是很具潜力的牧草植物,研究其遗传多样性具有重要的理论和实践意义。并根据国内的扁蓿豆的研究现状,提出了建议。     

盐碱及变温条件对花苜蓿种子发芽的影响

用3个变温处理(10/20℃,15/25℃,20/30℃)、6个浓度盐处理(盐为NaCl,浓度为0、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L)和碱处理(碱为Na2CO3,浓度为0、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L)研究盐、碱以及盐碱与温度的交互作用对两种不同来源花苜蓿种子萌发的影响。结果表明:随着盐、碱浓度的升高,种子发芽率、发芽速度均显著降低。低浓度盐、碱条件下,温度对花苜蓿种子发芽影响不显著;但在较高浓度的盐、碱条件下,不同温度处理对种子发芽率和发芽速度的影响差异显著;最适发芽温度为15/25℃。随着盐浓度升高,花苜蓿种子胚根长度逐渐减小,但胚轴长度没有明显变化;在一定浓度Na2CO3胁迫下花苜蓿能正常发芽,当Na2CO3浓度为15mmol/L(pH=10.95)时,两种花苜蓿发芽率均高于60%。两种花苜蓿相比较,林下花苜蓿抗盐碱性高于草甸花苜蓿。