猪繁殖—呼吸道综合征病毒（PRRSV）CH—1a株基因型鉴定

根据猪繁殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型毒株和欧洲型毒株的基因组序列设计合成了２对引物,即１００８ＰＳ／１００９ＰＲ和１０１０ＰＬＳ／１０１１ＰＬＲ。我国分离的ＣＨ－１ａ株用这２对引物均能扩增出与预期大小相符的ＲＴ－ＰＣＲ产物,分别与美洲型代表株（ＶＲ－２３３２）的ＲＴ－ＰＣＲ产物大小相当。特异性试验表明,这２对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的ＲＮＡ或ＤＮＡ以及未感染的ＭＡＲＣ－１４５细胞ＲＮＡ。间接免疫荧光试验也证明,ＣＨ－１ａ株与ＰＲＲＳＶ核衣壳蛋白特异性单克隆抗体以及美洲型毒株抗血清均呈阳性反应。因此初步证实ＣＨ－１ａ株为美洲型ＰＲＲＳＶ。     

用反转录—聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型标准毒株的ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７的序列，设计合成了一对引物２６３７４ ＰＳ／２６３７５ＰＲ，用反转录－聚合酶链反应技术对６株ＰＲＲＳＶ北京分离株进行了检测。结果该引物对６株病毒均能扩增出与预期大小相符的ＲＴ－ＰＣＲ产物，并与ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株扩增产物的大小相当，而欧洲型标准毒株未获扩增片段。     

猪生殖—呼吸道综合征病毒CH—1al株ORF2～7序列测定

新近发现的猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）是单股ＲＮＡ病毒，属不久前成立的动脉炎病毒科。为了比较从国内分离的ＰＲＲＳＶ与欧美ＰＲＲＳＶ毒株的分子遗传学关系，本文扩增并克隆了ＰＲＲＳＶ ＣＨ－１ａ株ＯＲＦ２￣７，测定了其核苷酸序列。与北美洲型代表株ＶＲ－２３３２遗传距离最近，可能来自同一祖先。     

我国猪繁殖和呼吸综合征病毒基因型鉴定

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从我国东北和华北地区分离的２个猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）毒株中扩增获得部分核衣壳蛋白基因。该基因片段长度与美洲型野毒株ＶＲ２３３２ＲＴ－ＰＣＲ扩增片段相同,均为４３３ｂｐ,长于欧洲型Ｌｅｌｙｓｔａｄ毒株扩增片段长度（３９５ｂｐ）。此外,用另１对引物,从这２个分离毒株及ＶＲ２３３２毒株扩增获得部分ＧＰ５蛋白基因,其限制性酶切片段长度多态性分析结果相同或相似。该结果表明,我国不同地区流行的ＰＲＲＳＶ可能属于同一毒株,并且来源于美洲。     

猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1a株ORF2～7序列测定

新近发现的猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）是单股ＲＮＡ病毒，属于不久前成立的动脉炎病毒科。为了比较从国内分离的ＰＲＲＳＶ与欧美ＰＲＲＳＶ毒株的分子遗传学关系，本文扩增并克隆了ＰＲＲＳＶＣＨ－１ａ株ＯＲＦ２～７，测定了其核苷酸序列。用序列分析软件进行核苷酸和氨基酸序列比较分析，结果表明ＣＨ－１ａ株与欧洲型代表株ＬＶ的遗传关系较远，与北美洲型代表株ＶＲ－２３３２遗传距离最近，可能来自同一祖先。     

用LSAB免疫组化染色法检测猪生殖—呼吸道综合征病毒抗原？…

本研究在国内首次成功建立了辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素－生物系（ＬＳＡＢ）免疫组化染色法检测猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）抗原。应用ＬＳＡＢ染色技术检测１２头人工感染ＰＲＲＳＶ美洲株（ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２）或国内分离株（Ｂ９６－４，Ｂ９６－５）的ＳＰＦ仔猪组织细胞内的ＰＲＲＳＶ抗原，阳性检出率为１００％。     

从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究

采用猪肺巨噬细胞和Ｍａｒｃ－１４５细胞培养对国内暴发流行ＰＲＲＳ的某地猪场进行了病毒分离，从流产胎儿分离出特征性致细胞病变因子，用ＰＲＲＳＶＳＤＯＷ－１７单克隆抗体进行间接免疫荧光染色，证明从４头流产胎儿分离到４株ＰＲＲＳＶ（ＣＨ－ｌａ，ＣＨ－１ｂ，ＣＨ－ｌｃ，ＣＨ－ｌｄ）这４株毒均可在猪肺巨噬细胞和Ｍａｒｃ－１４５ 细胞上生长，并产生特征性ＣＰＥ变化，用ＰＲＲＳＶ美国分离毒株ＶＲ－２３３２和ＮＶ     

猪繁殖与呼吸道综合征RT-PCR诊断方法的建立

根据猪繁殖与呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）核衣壳蛋白ＯＲＦ７的序列,设计了１套引物,对立了检测ＰＲＲＳＶ核酸的ＲＴ－ＰＣＲ方法。通过对猪繁殖与呼吸道综合征（ＰＲＲＳ）标准毒株的检测,证明该方法不仅能够扩增出特异性的核酸片段。同时可以从基因水平上区分ＰＲＲＳＶ美洲型和欧洲型。使用该方法对国内临床上疑似为ＰＲＲＳ的送检样品进行检测,结果为阳性,并确定基因型均为美洲型。该研究建立的从组织中直接提取细胞总     

猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)分离鉴定及其与欧、美PRRSV抗原的比较

在我国吉林省某地猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）抗体阳性猪群的４头２日龄弱仔猪实质脏器中分离到２株ＰＲＲＳＶ。间接荧光抗体试验（ＩＦＡ）结果表明,ＰＲＲＳＶ（ＬＶ．ＶＲ－２３３２）抗血清与２个分离株呈阳性反应;分离到病毒的弱仔猪血清与参考株（ＬＶ．ＶＲ－２３３２）也呈阳性反应;而分离株与ＨＣＶ、ＰｒＶ、ＰＰＶ、ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ和ＨＥＶ无交叉抗原。以上试验证明,我们已成功地分离到２株地方性ＰＲＲＳＶ。进一步用六种ＰＲＲＳＶ单抗（Ａ～Ｆ）进行ＩＦＡ试验,结果２个分离株与ＶＲ－２３３２的荧光反应谱相同。说明它们之间在抗原结构上具有同源性。     

用单克隆抗体鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株

应用ＰＲＲＳＶ单克隆抗体,采用直接与间接免疫荧光抗体试验对分离获得的ＰＲＲＳＶ６个毒株进行了鉴定,结果所有分离毒株均能被单克隆抗体（ＳＤＯＷ１７、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）所识别,呈现特异荧光,６个分离毒株均能与仅识别美洲型ＰＲＲＳＶ的单克隆抗体Ｆ反应,结果表明６个分离毒株均属于美洲型ＰＲＲＳＶ。利用微量细胞培养对分离毒株ＴＣＩＤ５０测定结果表明,６个分离毒株的ＴＣＩＤ５０分别为１０－７．５／０．１ｍｌ、１０－７．５／０．１ｍｌ、１０－７．５／０．１ｍｌ、１０－７．７５／０．１ｍｌ、１０－７．２５／０．１ｍｌ、１０－６．２５／０．１ｍｌ。病毒感染细胞的超薄切片电镜观察表明,在感染细胞浆内可见典型的ＰＲＲＳＶ病毒粒子,呈球形或椭圆形,直径约为６０ｎｍ左右,可见囊膜。     

PRRSV分离株GP3蛋白ORF3基因克隆及序列分析

为研究宁夏地区猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的流行规律,应用RT-PCR的方法从PRRSV分离株GP3蛋白中扩增出ORF3基因cDNA片段。结果显示,ORF3基因全长765 bp,编码254个氨基酸,与北美型毒株VR-2332的同源性达到85%以上,与欧洲型毒株LV的同源性低于60%,与国内近3年主要流行毒株JXA1、HEB1、HUB2亲缘性较近。对PRRSV分离株的亲水性分析表明,GP3蛋白的前57位氨基酸为疏水性信号肽序列;对PRRSV分离株GP3蛋白抗原表位分析表明,与国内外其他毒株抗原表位预测的结果基本一致,说明PRRSV分离株GP3蛋白具有与其他毒株相近的抗原特性。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因的克隆与鉴定

猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的基质膜（Ｍ）蛋白和核衣壳（Ｎ）蛋白是２种重要的结构蛋白。本试验根据ＰＲＲＳＶ美洲毒株的基因序列,设计了能够扩增Ｍ和Ｎ蛋白基因的１对引物,并在２个引物的两端分别加入ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点,经ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了一约９５０ｂｐ的目的基因片段,并将此基因克隆于ＰＢＶ２２０载体,构建了ＭＮ蛋白基因重组质粒ＰＢＶＭＮ,进一步由重组质粒回收ＭＮ基因片段亚克隆于ｐＳＫ＋（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋）测序载体,构建了重组质粒ＰＢＳＭＮ,经部分序列分析鉴定,重组质粒含ＭＮ蛋白基因。此基因的克隆为进一步研究该病毒ＭＮ蛋白免疫学特性及其分子基础和基因诊断技术奠定了基础。     

Differentiation between porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates by restriction fragment length polymorphism of their ORFs 6 and 7 genes.

Three distinct antigenic profiles were identified by comparing the reactivities of 15 Canadian field isolates, the attenuated U.S. vaccine (Ingelvac MLV) strain and 2 European reference strains (Lelystad and Weybridge) of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by indirect immunofluorescence with a set of 4 monoclonal antibodies to the nucleocapsid (N) protein and 2 other to the matrix (M) protein. In the present study, 9 Canadian isolates for which the sequences were determined appeared closely related to 2 U.S. reference strains (ATCC VR-2332 and ATCC VR-2385) with amino acid identities varying between 90 to 98% for the M and N proteins; substitutions in the nucleotide sequences were distributed randomly throughout the ORFs 6 and 7 genes, and most were 3rd base silent mutations. In comparison, more than 30% divergence was demonstrated with the Lelystad virus. Furthermore, differentiation between North American and European isolates, and between field isolates and the MLV strain could be achieved by cutting PCR-amplified products encompassing both ORFs 6 and 7 genes with 4 restriction endonucleases. When taken individually, BsaJI and AluI were the more appropriate restriction enzymes for distinguishing the vaccine strain from field isolates. The results obtained suggest that the restriction fragment length polymorphism of the genomic region covering the ORFs 6 and 7 genes may be a valuable tool to differentiate among PRRSV isolates.     

PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM F92株qPCR区分方法的建立与应用

 
为快速准确区分PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM F92株以及对流行毒株进行定量检测,按GenBank中发表的美洲型PRRSV SX 1分离株、弱毒疫苗株NSP2基因缺失部位的不同设计了一对特异性引物,通过RT PCR和体外转录的方法,构建了体外转录RNA作为标准品,并对反应条件和反应体系进行优化,旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性和稳定性良好的qPCR鉴别方法。结果表明,该方法最低能检测出1.0×101拷贝/μL的模板,敏感性比常规PCR高100倍;应用该方法对218份临床样本进行鉴别与定量,qPCR检出率较常规RT PCR高12.9个百分点。研究表明,qPCR鉴别方法的建立实现了对PRRS流行毒株与疫苗毒株的快速区分以及对流行毒株的定量检测,为PRRS的快速诊断提供了依据。     

1株NADC30-like重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及遗传变异分析

为研究山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行病毒株的遗传变异情况,本研究从山东省威海市某疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集的猪肺脏组织中分离到1株PRRSV,命名为SDwh,并对其进行了全基因组序列测定、遗传演化分析和重组分析.结果显示:该病毒株在Marc-145细胞上生长良好,可见明显细胞病变;全基因组演化分析和同源性比对分析结果显示,SDwh株与美国病毒株NADC30和中国的NADC30-like位于同一分支;与北美病毒株NADC30的同源性最高,为93.1%;与我国分离的NADC30-like病毒株CHsx1401、JL580的同源性分别为91.1%和88.4%;与北美经典病毒株VR2332、中国HP-PRRSV JXA1和HuN4的同源性均为85.3%;与欧洲型病毒株Lelystad-virus(LV)同源性最低,为60.6%.与VR2332相比,Nsp2氨基酸序列比对结果显示,SDwh株存在NADC30-like病毒株典型的131个不连续氨基酸的缺失,同时在584~585位缺失2个氨基酸;GP5氨基酸序列比对结果显示,SDwh在GP5抗原表位上有氨基酸的突变.全基因组重组分析结果显示,SDwh株是一株重组病毒株,为NADC30与JXA1-P80的重组病毒,潜在的重组位点位于Nsp2中(2066 nt).本研究结果为PRRSV流行株的重组、演化分析和防控提供借鉴意义.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)协同感染细菌性疾病的分析研究

为了解湖北某养殖场猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行毒株的遗传变异和临床感染情况,试验采集10份疑似PRRS发病仔猪的肺脏、淋巴结等临床样品,应用RT-PCR方法扩增PRRSV的Nsp2部分基因用于定性检测分析,并对扩增的其中2份PRRSV阳性样品进行ORF5基因核苷酸序列测定,结合不同疫苗毒株开展同源性比对分析。为进一步揭示病因,通过多重PCR方法对10份发病猪的肺脏和12份鼻拭子样品进行了相关致病菌的鉴定,并对其中的2株不同病原菌开展药敏试验。结果显示,10份临床样品中有5份检测到美洲型变异PRRSV,病原阳性率为50%。ORF5全基因序列分析表明,2个流行毒株间的核苷酸同源性为99.7%,与以TJM-F92、JXA1-R、HuN4-F112等为代表的高致病性致弱疫苗毒株核苷酸同源性最高,为96.7%~97.0%;与美洲型标准毒株VR2332的同源性分别为87.6%和87.9%;与国内较早分离的经典毒株（CH-1R和R98株）的核苷酸同源性分别为92.9%和87.4%、87.7%。患病猪临床常见感染模式为PRRSV+PM+SS、PRRSV+PM或PRRSV+HPS,2株主要致病菌药敏试验表明,多杀性巴氏杆菌对头孢曲松、阿莫西林等药物高度敏感,猪链球菌对阿莫西林、氨苄西林、阿奇霉素等药物高度敏感。本研究揭示了该场保育猪的发病病原,并从分子水平明确了临床PRRSV与不同疫苗毒株的亲缘关系,为弱毒疫苗的合理选择使用和综合防控PRRS提供了实践依据。     

Evaluation of protective immunity in gilts inoculated with the NADC-8 isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and challenge-exposed with an antigenically distinct PRRSV isolate.

OBJECTIVES: To determine whether intrauterine inoculation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) interferes with conception and whether exposure to one strain of PRRSV provides protection against challenge-exposure (CE) with homologous or heterologous strains of PRRSV. ANIMALS: 40 gilts. PROCEDURE: Gilts were inoculated by intrauterine administration of a PRRSV isolate (NADC-8) at breeding. Inoculated and noninoculated gilts were exposed oronasally to homologous (NADC-8) or heterologous (European isolate) PRRSV during late gestation. Specimens from gilts and fetuses were tested against CE virus. Lack of virus in gilts indicated protective immunity for the dam, in fetuses indicated protection of gilt from reproductive losses, and in both groups indicated complete protection. RESULTS: In the homologous CE group, interval from inoculation to CE ranged from 90 to 205 days, and protection was complete. In the heterologous CE group, interval from inoculation to CE ranged from 90 to 170 days, and protection was incomplete. The CE virus was detected in gilts necropsied 134 to 170 days after CE and in a litter necropsied 170 days after CE. CONCLUSIONS: Homologous protection can be induced in gilts by exposure to live PRRSV. Heterologous protection from reproductive losses can be induced in gilts by exposure to live PRRSV; however, this protection is incomplete and may have a shorter duration than homologous protection. CLINICAL RELEVANCE: Exposure of swine to enzootic PRRSV will provide protection against homologous PRRSV-induced reproductive losses. Extent and duration of protection against heterologous PRRSV may be variable and dependent on antigenic relatedness of the virus strains used for inoculation and CE.