荧光定量PCR检测牛性别相关基因DAX1表达的标准质粒和标准曲线的构建

本研究根据GenBank中登录的剂量敏感的性别反转－先天性肾上腺发育不良基因1(dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1，DAX1)设计引物，构建包含DAX1基因cDNA片段的质粒，作为中国荷斯坦牛DAX1基因mRNA定量检测的标准品，建立了DAX1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法。结果表明，该方法特异性好，检测灵敏度达102拷贝，线性范围为102～106拷贝，阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值间有着良好的线性关系(r=0.99975),扩增效率高(E=100%)，可以作为检测牛DAX1基因mRNA定量检测方法。     

啮齿柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测啮齿柠檬酸杆菌(C.rodentium)esp B基因的方法,本研究根据Gen Bank中登录的C.rodentium esp B基因序列设计1对特异性引物,建立了C.rodentium SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。结果显示,在102拷贝/μL~108拷贝/μL浓度范围内标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系。该方法仅对C.rodentium进行特异性扩增,而对牛棒状杆菌、鼠伤寒沙门菌、嗜肺巴斯德杆菌、支气管鲍特杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌扩增结果均为阴性,具有良好的特异性。其检测灵敏度可达24拷贝/μL。组内和组间试验变异系数均小于1%,重复性良好。临床样品初步应用结果显示,荧光定量PCR阳性检出率为56.36%(31/55),常规PCR阳性检出率为30.91%(17/55),二者符合率为74.55%。本研究建立的C.rodentium SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法为实验动物C.rodentium的检测和流行病学调查提供了技术支撑。     

小鼠β-actin mRNA荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立定量检测小鼠β-actin mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为小鼠相关基因表达水平的分析提供方法。根据GenBank中登录的小鼠β-actin mRNA序列,针对保守区域设计并合成1对引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ技术的小鼠β-actin mRNA荧光定量PCR方法。结果表明,该方法扩增效率高(97.7%),定量线性范围广(9.3×10²~9.3×10⁷拷贝/反应),可重复性强,无非特异性扩增和引物二聚体,最小检出量为9.3拷贝/反应。试验结果为β-actin作为内参基因用于小鼠相关基因转录水平分析提供了基础。     

牛轮状病毒VP7基因荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立快速特异的定量检测牛轮状病毒(BRV) VP7基因的荧光定量PCR检测方法,本研究设计扩增BRV VP7基因的特异性引物,将扩增的VP7基因片段(342 bp)克隆于pMD 18-T载体中(pMD-VP7),作为重组质粒标准品,建立EvaGreen荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法.经反应条件优化,结果表明该方法的最低检测量为8.03拷贝/μL.该方法对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、猪流行性腹泻病毒及牛结核分枝杆菌的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性.批内和批间重复变异系数均小于3％.采用该方法对12份ELISA阳性样本检测出10份阳性,符合率83.33％.本研究建立的BVR VP7 qRT-PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和对标本的检测能力较强等特点,可以用于临床诊断和流行病学调查.     

牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以牛支原体p80基因为靶基因,设计特异性引物与探针,优化反应体系,建立了牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR(TaqMan real-time PCR)检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性评估以及临床样本检测。结果显示,特异性试验中,牛支原体2个菌株Cq值均小于18,其余13个非牛支原体菌株Cq值均大于36;敏感性试验中,最低可检3.89拷贝/μL靶DNA,是普通PCR的10~4倍(普通PCR 3.89×10~4拷贝/μL);重复性试验中,组内、组间重复的变异系数均小于1%;44份牛的临床样品利用TaqMan real time PCR检出6份阳性(阳性率为13.64%),分离培养鉴定检出7份阳性,普通PCR检测全部阴性。本研究建立了一种敏感、特异、稳定的牛支原体TaqMan real time PCR检测方法,可用于牛支原体的快速诊断和核酸定量检测。     

性别相关基因在牛早期性别发育中的表达规律研究

旨在研究SRY、SOX9、DAX1和FOXL2 4个性别相关基因在早期牛胎儿中的表达情况,阐明其表达规律。收集34~80胎龄(dpc)牛早期胎儿的生殖嵴和中肾,先确定其性别,然后采用荧光定量PCR和免疫组化方法分别对SRY、SOX9、DAX1、FOXL2基因在RNA和蛋白水平进行定量和定位检测。经4对引物的性别鉴定,19个胎儿中10个为雄性,9个为雌性。SRY基因只在雄性中表达,而FOXL2基因在雌性中有显著表达,在雄性中则有痕量的表达。在雄性生殖嵴中,SOX9和DAX1的表达模式相似,但在44~56dpc DAX1表达量高于SOX9;在38~80dpc的雌性生殖嵴中,DAX1的表达量持续高于SOX9,且53dpc后,SOX9表达量持续维持低水平,而DAX1表达量却急剧升高到80dpc。可见,牛早期胎儿雄性的性别决定时间为35~39dpc,雌性则为39~41dpc;且SRY和FOXL2分别为牛早期胎儿雄性和雌性的性别决定基因,本研究初步揭示了牛早期胎儿性别相关基因的表达规律,为家畜性别控制提供理论基础。     

实时荧光定量PCR法检测转基因牛拷贝数

为了检测bfat-1转基因牛的外源基因拷贝数,试验采用绝对定量PCR法鉴定外源基因的拷贝数。结果表明:绝对定量PCR可以准确、有效地检测转基因牛外源基因的拷贝数,标准曲线为lnN=-3.16Ct+40.76(R2=0.994 2),2头转基因牛的外源基因拷贝数分别为4.62±1.03,5.46±1.26。     

内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按103～107拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r2=0.998、r2=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%（107拷贝/反应除外）,说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用

以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的保守基因5'-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为101~106copies/μL,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.78。灵敏性比常规PCR高102倍。该方法具有良好的特异性,检测变异系数低于1%。应用本实验建立的方法检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品,阳性检出率为72%(18/25),与病毒分离培养和电检观察相比,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。     

Polymicrogyria in Standard Poodles

Background: Polymicrogyria is a disorder of cerebrocortical migration resulting in increased numbers of small, disorganized gyri. This disorder occurs in Standard Poodles and in cattle.
Objectives: To describe the clinical, electroencephalographic, imaging, and histopathologic features in poodles with polymicrogyria.
Animals: Five Standard Poodles with histologically confirmed polymicrogyria.
Methods: Retrospective case series. Cases were obtained by personal communication with 1 of 2 authors (TJVW, DPO).
Results: All dogs had cortical blindness and other neurologic abnormalities including gait and behavioral changes. Magnetic resonance imaging of 3 dogs showed multiple disorganized gyri, which were especially apparent on T2-weighted dorsal plane images. Electroencephalogram (EEG) of 1 dog revealed epileptiform discharges, including both spike and spike and wave discharges with voltage maximum potentials over the parietal/occipital region. The EEG supported that the repetitive behavior displayed by the dog was a complex partial motor seizure. One dog had concurrent hydrocephalus. All dogs had occipital lobe involvement and 2 dogs had involvement of other lobes.
Clinical Importance: The cases presented here demonstrate a larger age range (7 weeks to 5 years) and a decreased frequency of associated hydrocephalus when compared with the previous report.     

七彩山鸡营养标准的试验研究

制订七彩山鸡不同饲养阶段的营养标准 ,并进行了饲喂效果试验 ,结果表明 ,15周龄的七彩山鸡平均体重可达 1 6 31kg ;料重比为 3 199∶1,此营养标准基本能满足山鸡生长发育的需要     

汽车标准件三维图库的参数化设计与应用

使用VB 6.0和ACCESS数据库为开发工具,在CATIA平台进行汽车标准件三维图库基于VBScript脚本的参数化设计,并以等长双头螺柱标准件为实例介绍了应用过程。该标准件图库界面友好,操作方便,能与CATIA良好对接,节省了设计时间,提高了企业设计效率。     

鹿茸骨宝胶囊质量标准的研究

为建立鹿茸骨宝胶囊的质量标准,采用薄层色谱法对胶囊中的鹿茸、淫羊藿、槐角进行了定性鉴别;采用高效液相色谱法测定了胶囊中淫羊藿苷含量.结果表明:薄层色谱斑点清晰,空白样品无干扰,可用于本品质量控制;淫羊藿苷在0.051 25～1.025μg范围内具有良好的线性关系r=0.999,平均加样回收率为98.78%,RSD为1....     

浅谈大型猪场的规范生产

近年来，由于养猪规模不断扩大和其他因素影响，猪场的生产安全受到极大威胁。因此，大型猪场要想保证安全、有序的生产，必须将安全生产意识贯彻到每个生产环节。规范生产应包括猪场的选址布局、疫病防控、投入品选择及规章制度建立等方面内容。笔者经对大型猪场的调查研究，现将大型猪场规范生产的几方面内容进行论述，以供同行借鉴。     

实时荧光定量PCR构建朊病相关细胞因子标准品质粒和标准曲线

为能够用实时荧光定量PCR检测PrP106-126作用的鼠巨噬细胞细胞因子的表达水平,构建目的基因IL-1β、TNF-α、IL-6和内参基因β-actin的标准品质粒和标准曲线。根据GenBank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物;细胞经PrP106-126作用后,提取总RNA。经反转录、PCR扩增、纯化、连接和转化后,提取质粒并测序鉴定,获得IL-1β、TNFα-、IL-6和β-actin质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果显示,产物溶解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因和内参基因的标准品质粒和标准曲线。