应用琼脂免疫扩散试验检测番鸭细小病毒抗体

将分离的番鸭细小病毒通过正常发育的番胚传代,分别取不同代次的病毒尿囊液经氯仿、聚乙二醇浓缩处理后制成不同代次的抗原。该抗原与抗番鸭细小病毒抗血清在含有２０ｇ／ＬＰＥＧ６０００的琼脂平板上作用,可见有明显的沉淀线。     

应用琼脂免疫扩散试验检测猪伪狂犬病

应用琼脂免疫扩散试验对5个猪场共175份样进行猪伪狂犬病血清学检测，共检出阳性血清90份，阳性率51.4%，血清阳性猪场有4个，占所测猪场80.0%。说明猪伪狂犬病在黑龙江省呼玛县呈地方性流行趋势。     

禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究

用表达禽流感病毒（ＡＩＶ）核蛋白基因的杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞。以其表达产物制备抗原,建立了以杆状病毒系统表达的ＡＩＶ核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。其抗原最适包被量为０．６μｇ／孔,等检血清最适稀释度为１：２００,酶标抗体使用浓度为１：１０００。根据对１４０份ＳＰＦ鸡血清检测结果的统计分析,确定其判定标准为ＯＤ均为阴性;检测Ａ型ＡＩＶ１５个不同亚型（Ｈ１￣Ｈ１５）毒株的特异性血清均为阳性;对人工接种ＡＩＶ的ＳＰＦ鸡第３天即能检出抗体,到第１６２天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在２．９％￣７．２％和３．４％￣９．８％之间。对３１３８份鸡血清进行监测,ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ（ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ）、琼脂扩散     

禽网状内皮组织增殖病琼脂免疫扩散抗原的研制及应用

禽网状内皮组织增殖病（ＲＥ）琼脂免疫扩散抗原为淡粉以液体，具有良好的特异性，与抗鸡马立克氏病，鸡传染性氏囊病，禽白血病，鸡传染性贫血病，鸡新城疫病毒标准阳性清不发生交叉反应，抗还具有良好的敏感性，在实验室对人工感染ＲＥＶ和ＳＰＦ鸡７天即可检出抗体，检出率为４０％，１４天检出率为１００％，抗原在３７℃保存７天，在１５℃保存１５天，在４℃保存３０天，在一－２０℃至少保存１８０天，未见效价下降，用本抗原     

琼脂免疫扩散试验检测鸭病毒性肝炎抗原

琼脂免疫扩散试验检测鸭病毒性肝炎抗原孙泉云刘红（上海市畜牧兽医站,闵行２０１１０３）李劲松（南京农业大学动物医学院,江苏２１００９５）鸭病毒性肝炎（ＤＶＨ）已成为蔓延地区广、流行趋势快、危害严重的鸭传染病之一,因此,正确的诊断有助于本病的有效防治。对...     

应用琼脂免疫扩散试验检测猪伪狂犬病抗体的研究

建立了ＡＧＩＤ用于猪伪狂犬病（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ,Ｐｒ）的诊断。对９８份被俭血清的ＡＧＩＤ结果与ＳＮ结果比较,当ＳＮ滴度大于１：８时两者的阳性检出符合率为１００％,ＳＮ滴度小于或等于１：８时,两者的阳性检出符合率为８７．５％,ＡＧＩＤ和ＳＮ总的阳性符合率为９４．４％,结果表明,ＡＧＩＤ对Ｐｒ可进行特异性诊断,流行病学调查和免疫动态监测。     

赤羽病琼脂免疫扩散试验诊断方法的研究

应用引自美国和日本的羽病毒和标准阳性血甭,制备了琼脂免疫扩散试验（ＡＧＩＤ）抗原和高免阳性血清,建立了赤羽病ＡＧＩＤ诊断方法。应用此方法对上海、杭州、广州等地的１３８３头牛进行了检疫,ＡＧＩＤ抗体阳性牛７４６头,阳笥率５４．０％,与流行情况相符。同时对从澳大利亚、美国、新西兰和加拿大等国进口的牛、羊、猪血清１６２头份进行了检疫,全部为ＡＧＩＤ抗体阴性。     

猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用

根据GenBank中A/Swine/Hong Kong/126/82(H3N2)株猪流感病毒(SIV)NP基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增了我国SIV分离株A/Swine/Heilongjiang/3/2000(H3N2)的核蛋白(NP)基因.将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体,酶切鉴定后对其序列分析表明NP基因与香港分离株同源性高达93.8%,然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP.用pET-NP转化受体菌BL21,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品.经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG诱导下,6 h其表达量达到高峰,经Western blot分析证实表达的重组核蛋白具有反应活性,大小约为60kD.用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与SIV抗血清可形成清晰的反应沉淀线,而与其它9种猪病原阳性血清不发生反应.正常菌体蛋白与SIV阳性血清也不发生反应.通过对40份送检血清样品的检测结果显示其与HI试验的相符率高达95%以上.试验证明利用原核表达系统制备的重组核蛋白作为诊断用抗原,不仅制备过程简单而且所建立的琼扩诊断方法特异、快速、简便,其灵敏度也能满足现地的使用要求.目前正在进行现地的中试试验.     

琼脂免疫扩散试验检测鸭肝炎病毒抗体的研究

自Levine和Fabricant（1950）首次在鸭胚中分离到鸭肝炎病毒（DHV）以来[1]，各国学者对鸭病毒性肝炎的血清学诊断和免疫学监测等方面进行了大量研究。本病的琼扩试验虽有报道，但被认为特异性、敏感性存在欠缺。然而建立一快速简易、比较可靠且易被基层推广应用的检测手段是非常必要的。鉴于此，我们进行了琼扩（AGID）试验的研究，并取得较好结果。1材料与方法1．1材料1．1．1种毒：DHVC81弱毒株、ATCC（C9／D2）标准毒株、E52弱毒疫苗由南京农业大学动物医学院提供。1．1．2鸡胚：购自上海市农科院畜牧所。1．1．3试验鸭：来源于…     

H5亚型AIV HA抗原表位重组蛋白McAbs的制备及应用

目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。     

禽流感油乳剂灭活疫苗的研制

以禽流感病毒（AIV）H5N4株，H7N3株为抗原，分别研制了H5N4、H7N3油乳剂灭活疫苗，并对其物理性状、安全性、免疫效力、保存期及抗体消长规律进行了检测。结果表明，3种抗原含量不同的H5N4疫苗在免疫后3周－9个月对AIV－H5N4攻击均获8／8保护，H7N3疫苗在免疫后3周与3个月时对AIV－H5N4攻击则分别保护6／8与3／7，疫苗4℃保存15个月，其免疫效力没有下降。     

H9亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒构建

本试验构建了H9亚型禽流感病毒HA基因禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA进行PCR扩增,获得1.7kb的携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞,用H9亚型禽流感病毒多克隆血清作一抗,碱性磷酸酶标记的鸡IgG为二抗进行Western blot检测,结果表明重组痘病毒能在体外的CEF细胞表达HA糖蛋白。     

抗H9亚型禽流感病毒独特型抗体的制备与应用

用纯化的鸡抗H9亚型禽流感病毒（AIV）免疫球蛋白G（IgG）作为抗原免疫家兔，制备兔源多克隆抗独特型抗体（Pab2），同时免疫小鼠，应用细胞融合技术建立了分泌抗AIV独特型单克隆抗体（Mab2）的杂交瘤细胞系。经鉴定，2类抗独特型抗体均能竞争性地抑制鸡抗AIVIgG与AIV的结合。保护试验证实，兔源多克隆抗独特型抗体疫苗较单克隆抗独特型抗体疫苗具有更高的保护作用。     

禽流感H9亚型一步法RT-PCR快速检测试剂盒的研制及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的禽流感H9检测方法,本研究根据GenBank中收录的禽流感H9病毒高度保守的基因序列,设计1对H9的特异性引物,建立了一步法快速检测禽流感的PCR,对反应条件进行优化后,组装成快速检测试剂盒,并对临床收集的疑似禽流感病料进行检测。结果显示,试验成功建立了禽流感H9病毒一步法RT-PCR检测方法,在此基础上完成了试剂盒的组装,对30份疑似禽流感病料的检出率高达98%以上,检测灵敏度达10^1.5ELD₅₀,稳定性良好, 冷冻保存期达12个月。经证实该试剂盒具有操作简便、经济、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点,值得推广应用。     

3株表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的免疫效力比较

作者旨在探讨鸡痘病毒ORF073或ORF214基因缺失后,在母源抗体存在情况下对重组病毒免疫效力的影响。将构建好的在ORF073或ORF214基因插入H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-△73LRH5A、rFPVLP-△214LRH5A)及单表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-12LSH5A)分别免疫SPF鸡和商品鸡,检测重组疫苗诱导的免疫效力。结果:3种重组鸡痘病毒在SPF鸡产生较高的HI抗体效价及100%的免疫保护;在HI母源抗体效价为2.45的商品鸡体内基因缺失株重组病毒比rFPVLP-12LSH5A易于清除,抗体上升缓慢而且免疫28 d后HI抗体效价较低,免疫保护率低,分别为16.7%和23.3%;在母源HI抗体效价为0的商品鸡体内基因缺失株重组病毒免疫后产生的抗体效价高,免疫28 d后分别达到3.50和3.17。结果表明在商品鸡体内母源抗体影响下,缺失ORF073或ORF214基因的重组鸡痘病毒的免疫效力降低。     

NAS制剂在体外对H5N1、H9N2亚型禽流感病毒的杀灭效果研究

采用Klein—Defors悬浮杀灭方法,考察了那氏（NAS）制剂对H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的杀灭效果。将不同浓度的NAS制剂药物组与利巴韦林药物对照组与H5N1亚型和H9N2亚型病毒各分别混合10min和30min。后10倍递进稀释成10个稀释度,接种鸡胚尿囊腔。培养一定时间后采集尿囊液进行血凝试验（HA）,计算NAS制剂对两种亚型禽流感病毒在不同时间的杀灭率。结果表明,以1：40、1：80、1：160、1：320、1：640的稀释浓度与10^7-63 EID50禽流感H5N1亚型病毒液作用10min,病毒杀灭率分别为99．99％、99．99％、32．39％、0、0;作用30min杀灭病毒率分别为100％、99．99％、99．43％、0、0。与10^0.17 EID50 H9N2亚型禽流感病毒液作用10min,其杀灭病毒率分别为99．99％、99．99％、32．39％、0、0;作用30min病毒杀灭率分别为100％、99．99％、90％、0、0。提示NAS制剂对这两种病毒都有较好的杀灭作用,而且杀灭效果与时间有关。     

H5N1亚型禽流感病毒鸡胚分离株蚀斑克隆及生物学特性比较

建立了H5N1亚型禽流感病毒（AIV）蚀斑克隆方法，用不加中性红的营养琼脂为覆盖层，在倒置显微镜下挑斑，对3株H5N1亚型AIV鸡胚分离毒株进行了蚀斑克隆纯化，从同一鸡胚分离毒株中纯化得到了蚀斑大小和形态均存在显著差异的毒株，共获得13株蚀斑克隆纯化株。研究结果表明，当小牛血清浓度为2%时，加入终浓度50 μg/ml的胰酶可明显促进和刺激蚀斑的形成，蚀斑的直径和PFU/ml均有显著的增加。通过TCID₅₀、EID₅₀和LD₅₀测定发现，来自同一鸡胚分离株的不同蚀斑克隆纯化株中，蚀斑大、毒力强的克隆毒株占优势，而且蚀斑较大的，其毒力也较强。对得到的13株蚀斑克隆毒株的全基因组各片段序列分析表明，蚀斑克隆纯化株在HA蛋白裂解位点附近的氨基酸序列均符合高致病性通报性禽流感病毒的分子特征。     

金丝桃素可溶性粉对H5N1亚型禽流感病毒抑制作用的病理组织学观察

为了明确金丝桃素在体内对高致病性禽流感病的抑制效果，将64只28日龄免疫石岐杂黄鸡随机分为4组，即金丝桃素可溶性粉组、金刚烷胺组、阳性对照组及阴性对照组。运用病理组织学技术对各实验组鸡的心、肝、脾、肺等器官进行了观察。结果显示：阳性对照组及金刚烷胺组各器官病理变化明显，而金丝桃素可溶性粉组病理变化轻微，且有不同程度的淋巴细胞及网状内皮细胞增生。     

AIV感染雏鸡免疫器官T细胞免疫功能及IL-2诱生活性变化

应用组织培养技术及MTT法,对鹅源H5N1型AIV感染雏鸡胸腺、脾脏T细胞增殖功能及IL-2诱生活性进行检测,结果发现:雏鸡感染AIV后,免疫器官T细胞增殖功能和IL-2诱生活性在感染初期较对照雏鸡明显降低,后期有所恢复,表明AIV感染雏鸡细胞免疫受到抑制,中枢与外周免疫器官分子免疫调节功能障碍.7和21日龄AIV感染雏鸡均发病,但21日龄感染雏鸡上述指标的下降时间较7日龄感染雏鸡短且相对滞后,死亡率也较低,表明21日龄雏鸡免疫能力较强,具有一定的抗AIV感染能力.