传染性法氏囊病病毒广西流行毒株的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解传染性法氏囊病病毒(IBDV)广西流行株的遗传变异规律,本研究通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种的方法对2006年～2007年间采集自广西各鸡场的疑似传染性法氏囊病(IBD)的病料进行病毒分离,设计针对VP2高变区(vVP2)的引物对分离物通过RT-PCR进行鉴定及序列分析.共分离出9个IBDV毒株,其ELD50在105/0.2 mL～106/0.2 mL之间.分离株vVP2序列通过具有分型意义的酶切位点和关键位点氨基酸分析,证实9个分离株均属于vvIBDV.同源性分析表明,9个分离株之间在核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.2%～100%和95.2%～100%,与vvIBDV参考株同源性分别为93.8%～98.2%和92.4%～98.6%,而与常用疫苗株Bursine-2、B87(in),变异株GLS,经典毒株,中等偏强毒力株YL052的同源性仅有90%左右.遗传进化分析发现,分离株与vvIBDV参考株同处于1个大分支,与DV86和OKYM株的亲缘关系最近,与2000年～2005年问广西分离的vvIBDV株距离较远,它们之间形成了明显的分群.研究表明,近2年来广西仍然存在vvlBDV的流行.     

鸡传染性法氏囊病一个自然病例的病原分离及其分子特征分析

设计针对传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因高变区(vVP2)的引物对湖南永州送检的一群疑似传染性法氏囊病病例的法氏囊组织通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术进行检测,应用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种的方法对阳性样品进行病毒分离,同时对IBDV分离株中的vVP2进行限制性内切酶分析和核苷酸序列测定,分析关键位点的氨基酸特征和同源性,绘制遗传进化树.结果成功分离出了4个IBDV毒株,其中HUN0801、HUN0802和HUN0803的特征性位点的氨基酸为222A、249Q、254G、256I、279D、284A、294I和299S,属于vvIDBV的特征,并与vvIBDV参考株具有较高的同源性;HUN0804的则为222P、249Q、254G、256V、279N、284T、294I和299N,符合弱毒株的特征,与弱毒参考株的同源性较高;4个分离株与常用疫苗株的同源性普遍较低.遗传进化分析表明,3个vvIBDV分离株与vvIBDV参考株和中等偏强毒力株YSLMB同处于一个大的分支,并与欧洲株DV86、湖南株HuN亲缘关系最近;而HuN0804与弱毒株、经典毒株和常用疫苗株同处于一个大分支.研究表明,本病例中存在不同致病型IBDV毒株的混合感染.     

传染性法氏囊病病毒NN1107广西株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究从广西南宁市某鸡场疑似患传染性法氏囊病的鸡群中分离鉴定出的一株传染性法氏囊病病毒NN1107株的分子特征,通过反转录-聚合酶链反应特异扩增后进行克隆、序列分析。NN1107株VP2基因高变区(vVP2)的克隆测序和序列比较结果显示,序列符合超强毒传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)的分子特征;其与广西vvIBDV毒株的核苷酸同源性在96%～99.6%之间。根据vVP2核苷酸序列同源性绘制的遗传进化树结果显示,NN1107株属于vvIBDV毒株群,与2004年、2005年、2007年和2010年流行毒株BH09、NNTZ(3)、NN07122、HP1001的亲缘关系最近,与疫苗株B87(in)、Bursine-2、FW2512株的亲缘关系较远。     

单色光对产蛋期蛋鸡脾脏组织结构及脾细胞增殖的影响

为了解传染性法氏囊病病毒（IBDV）广西流行株的遗传变异规律，本研究通过鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）接种的方法对2006年-2007年间采集自广西各鸡场的疑似传染性法氏囊病（IBD）的病料进行病毒分离，设计针对VP2高变区（vVP2）g／引物对分离物通过RT—PCR进行鉴定及序列分析。共分离出9个IBDV毒株，其ELD50在105／0．2毫升～106．5／0．2毫升之间。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒江苏分离株的鉴定及其致病特征分析

对2009年采自江苏南京的疑似鸡传染性法氏囊病(IBD)的病料进行了鸡胚分离纯化,通过琼脂扩散、红细胞凝集、血清中和试验、RT-PCR等试验确定分离毒NJ09是传染性法氏囊病病毒(IBDV)。对其VP2基因序列分析显示:NJ09与美国CAHFS_K669分离株及中国的B-SDRZ、SD10LY01分离株亲缘关系较近,共同聚类于一个超强毒株分枝,说明NJ09是一个IBDV超强毒株(vvIBDV)。致病性测定结果显示:NJ09对鸡胚的半数致死量(ELD_(50))为1065/02 mL,对60日龄SPF鸡的攻毒发病率和致死率分别达100%和60%。免疫原性测定结果显示:NJ09的灭活疫苗有较好的保护效果,血清中和抗体值达156 log2。上述结果表明,NJ09是一株vvIBDV,致病力强,免疫原性好,在后续IBDV疫苗研发中是潜在的高效种毒来源。     

鸡传染性法氏囊病病毒地方流行株VP1基因片段的扩增及序列分析

为了解鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)地方流行毒株在基因组B节段关键序列上的分子进化情况,通过反转录PCR(RT-PCR)技术对6个IBDV不同地方分离株的VP1基因中与病毒致病型相关的一个片段(1 518bp~1 997bp,共480bp)进行扩增,并对所获得的VP1 480bp片段进行核苷酸的序列测定,与IBDV参考株和常用疫苗株的相应序列进行比较分析和绘制遗传进化树。结果表明,6个分离株与参考株在VP1RNA聚合酶基序Ⅵ和基序Ⅶ上均保守,在特征性氨基酸位点上,3个广西分离株QX0604、WZ0704和NN0603与参考的vvIBDV相同,而分离株BH111(广西)、JS17(江苏)和HUN0804(湖南)则既具有vvIBDV的位点特征,又具有经典毒株特征,但不同毒株在不同位点上表现不同;在同源性分析上,JS17、BH111、QX0604、WZ0704和NN0603等5个毒株与参考用vvIBDV毒株的同源性较高,在核苷酸和氨基酸水平上分别为92.5%~100.0%和97.5%~100.0%,但与2个常用疫苗株和经典毒株的同源性仅分别为87.9%~90.0%和96.2%~96.9%,分离株HUN0804则与经典毒株和2个疫苗株更接近;在遗传进化树上,JS17和BH111等5个分离株与vvIBDV在一个分支上,亲缘关系更近,而HUN0804则与经典毒株和2个疫苗株在另一个大分支。表明不同分离株在VP1的功能基序上保持保守,但分离株在特征性氨基酸位点上则发生了变化,大多数分离株与常用疫苗株之间的同源性较低,亲缘关系较远。     

广西地区传染性囊病病毒超强毒株的分离鉴定及其VP2基因高变区的序列分析

研究通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种、琼脂扩散试验、致细胞病变和RT-PCR等方法,成功从广西疑似病鸡的腔上囊组织中获得了8个传染性囊病病毒(IBDV)毒株,分离株可致攻毒鸡发病率100%,死亡率60%～90%;分子特征上,8个分离株VP2高变区在酶切位点和特征性氨基酸上均属于vvIBDV的特征.同源性分析表明,8个分离株之间在核苷酸和氨基酸上的同源性分别为96.8%～99.1%和95.9%～99.3%,与其他参考vvIBDV毒株的同源性分别为94%～97.7%和92.5%～97.3%,而与常用疫苗株Bursine-2、B87(in),变异株GLS,经典强毒株的同源性仅有90%左右.遗传进化树上,8个分离株与国内外参考vvIBDV同处于一个大分支,与疫苗株和经典强毒株的距离较远,8个分离株与中国内地毒株SD1/97的亲缘关系最近.研究表明,广西仍然存在vvIBDV的流行.     

IBDV野毒株的分子生物学鉴定

取3个分离于山东地区几个鸡场IBDV野毒株IBDV SD01、IBDV SD02、IBDV SD03,利用Trizol试剂提取IBDV RNA,设计特定的引物,通过RT-PCR和Nested-PCR,获得分离株的VP2基因高变区的特定序列,并对其进行克隆和序列分析结果表明,分离的3个野毒株在VP2高变区与超强毒株HK46有较高的同源性,关键氨基酸位点都符合超强毒株的特征,与一般的强毒株、变异株和疫苗株的亲缘关系较远。这些关键位点氨基酸的变化使vvIBDV能够逃脱低毒力抗原所产生抗体的捕捉,导致了免疫鸡的发病。     

鸡传染性法氏囊病毒超强毒株的分离及生物学特性鉴定

用SPF鸡及鸡胚，从吉林某鸡场病死鸡的法氏囊组织到一株超强毒株（J20株）。此病毒不能凝集鸡的红细胞，可以被IBDV标准阳性血清检出IBDV抗原。通过对J2001分离毒株进行回归实验，测定病毒效价EID50达10^6/0.2ml，发病率为100％，死亡达70％；病毒理化特性试验，电镜观察等证实J20株为鸡传染性法氏囊病超强毒株。     

鸡传染性法氏囊的治疗

鸡传染性法氏囊病(IBD)又称鸡传染性腔上囊病。传染性法氏囊病毒属双RNA病毒科,包括两个血清型。根据毒株的致病性,IBDV可分为无致病力(血清II型)、弱毒力(疫苗株)、经典强毒、变异株和超强毒株。血清II型株不引起鸡的法氏囊损伤和鸡只死亡。弱毒力株不引起死亡,但根据其毒力的差异对法氏囊造成不同程度的损伤。经典强毒株引起     

用免疫胶体金试纸膜检测超强毒IBDV对SPF鸡侵染性变化研究

用免疫胶体金试纸膜检测人工感染GX-8/99株超强毒株传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)SPF鸡,检测9天内这九种病料病毒含量的变化,进一步揭示了VVIBDV对鸡体内各组织的侵染性变化规律.     

鸡传染性法氏囊病病毒在DT40细胞中的增殖规律

为了系统地研究IBDV弱毒在DT40细胞系中的增殖规律,作者探讨了IBDV弱毒株对DT40细胞的侵染性以及不同培养条件对IBDV在该细胞中增殖的影响.结果表明,在基础维持液培养条件下,IBDV TAD和HN32个弱毒株均不需要传代适应过程即町直接感染DT40细胞,并在其中增殖;而在细胞最佳生长液条件下,IBDV可伴随宿主细胞的快速分裂而增殖,并可在较长培养时间内进行连续、大量的病毒收获.本研究表明DT40细胞可以作为深入探讨IBDV分子致病机制的良好靶细胞模型,其同时也可能为生产IBDV商品化疫苗提供一种潜在便捷的工具细胞.     

藏药"十三味红花丸+琼阿"对IBDV的抑制试验研究

试验利用藏药“十三味红花丸 琼阿”对鸡胚人工感染IBDV进行了抑制试验，试验结果显示，藏药药液（1g/mL）用2倍、4倍、6倍和8倍稀释，对鸡胚感染IBM强毒的保护率分别达100%、100%、90%和80%，IBDV强毒对照组分别提高80、80、70和60个百分点。试验结果表明，藏药“十三味红花丸 琼阿”对IBDV具有很强的抑制作用。     

藏药 "十三味红花丸+琼阿"对IBDV的抑制试验研究

利用藏药"十三味红花丸+琼阿"对鸡胚人工感染IBDV进行抑制试验研究.试验结果显示,藏药药液(含生药1 g/mL)作2倍、4倍、6倍和8倍稀释后对鸡胚感染IBDV强毒的保护率分别为100%、100%、90%和80%,比对照组分别提高80%、80%、70%和60%.表明藏药"十三味红花丸+琼阿"对IBDV具有很强的抑制作用.     

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(TL2004)A节段cDNA的克隆及序列分析

用Long accurate RT—PCR（LA-PCR）的方法一步法克隆了IBDV TL2004基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明：克隆的A节段全长3260个核苷酸，包括5＇、3＇的非编码区（NCRs）和2个重叠的开放阅读框（ORF1和ORF2），与来自GenBank IBDV血清Ⅰ型毒株核苷酸序列的同源性高达95．2％～99．2％。二级结构分析表明，在5＇-NCRs和3＇-NCRs各存在一个大型的颈环发夹结构。ORF1编码1012个氨基酸的VP2-VP3-VP4，在氨基酸水平上VP2、VP3、VP4与参比Ⅰ型毒株的同源性分别达96．7％～99．6％、94．2％～99．2％、96．7％～99．6％。ORF2编码145个氨基酸的VP5，与参比I型毒株的同源性高达95．9％～99．3％。TL2004在第2个小亲水区内279位氨基酸由S替代了N、290位M替代了L，这2个突变可能是IBDV抗原漂变的原因。分子系统进化树分析表明，TL2004与欧洲Cu21株和中国JD1、Harbin株的关系较近．而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。     

Ⅰ型与Ⅱ型IBDV前体多聚蛋白B细胞抗原表位的预测与比较

用生物信息学方法比较了GenBank中9株Ⅰ型IBDV与2株Ⅱ型IBDV基因片段A前体多聚蛋白的推导氨基酸(aa)序列,预测并分析了上述两型IBDV毒株前体多聚蛋白的线性B细胞抗原表位.结果表明,两型IBDV毒株的前体多聚蛋白有75个aa残基的差异,其上大多数预测B细胞抗原表位的位置及其指数值均无明显差异;但两型IBDV在第3～10位中的aa残基差异影响了该序列肽的预测指数和结构,以及与Ⅰ型IBDV多抗的反应性.     

河北地区鸡IBDV分离株VP2高变区的序列分析

以河北地区不同鸡IBDV基因组RNA为模板。采用RT-PCR／Nested-PCR的方法，得到其VP2高变区的cDNA片段后进行测序，并将其序列与本实验室已测定的周边省市及文献已报道的IBDV毒株相应区域进行了比较。结果表明，河北地区与周边省市间的IBDV毒株同源性极高，与欧洲细胞毒株Cu1和P2间具有很高的同源性，而与美国变异株VariantE的亲缘关系相距较远。     

藏药“十三味红花丸+琼阿”抑制IBDV增殖初步研究

试验利用SPF鸡胚初步观察了藏药“十三味红花丸 +琼阿”对传染性法氏囊炎病毒 (IBDV)增殖的影响 ,结果显示 ,2倍、 4倍、 6倍和 8倍稀释的藏药药液 (1g/mL) ,可明显降低IBDV感染鸡胚死亡率 ,表明藏药“十三味红花丸 +琼阿”对IBDV增殖具有较强的抑制作用     

鸡β-防御素-1对鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗的免疫佐剂作用

本文旨在研究鸡β-防御素-1(AvBD1)对鸡IBDVVP2基因DNA疫苗的免疫佐剂作用。通过基因工程技术,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcDNA3.1(+)-VP2。14日龄岭南黄肉鸡随机分成5组,分别免疫PBS、空质粒载体pcDNA3.1(+)、重组质粒pcDNA3.1(+)-VP2、重组质粒pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcD-NA3.1(+)-VP2联合免疫、IBD弱毒苗。收集免疫后不同时期的外周血血清样本,用ELISA方法检测血清中IB-DV VP2特异性抗体水平,通过流式细胞仪检测CD3+、CD4+与CD8+T淋巴细胞的含量。结果表明,联合免疫组(即pcDNA3.1(+)-AvBD1与pcDNA3.1(+)-VP2共同免疫)VP2特异性抗体水平显著高于其他组;单独免疫质粒pcDNA3.1(+)-VP2组VP2特异性抗体水平与免疫IBD弱毒苗组相当,显著高于PBS组与空质粒载体pcD-NA3.1(+)组。在二免后第7天,联合免疫组外周血中CD3+、CD4+与CD8+T淋巴细胞的含量也显著高于单独免疫质粒pcDNA3.1(+)-VP2组,其它时间无显著性差异。IBDV攻毒...     

基于RNA聚合酶Ⅱ的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立

应用重叠PCR法在鸡传染性法氏囊病病毒基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入具有自我剪切功能的核酶HamRz和HDV序列,然后分别将含有核酶序列的A、B节段构建到pCI真核栽体当中,构建真核载体pCI-ma核pCI-mb.在脂质体介导下,将pCI-ma和pCI-mb共转染Vero细胞.细胞病变观测、间接免疫荧光试验和分子标记检测证实成功实现了鸡传染性法氏囊病病毒的遗传拯救.