中国地方品种丝羽乌骨鸡白细胞介素2基因的克隆及遗传进化分析

鸡白细胞介素2（ChIL-2)是近年来新发现的一类细胞因子。根据Sundick等发表的鸡IL-2基因序列设计一对特异性引物,从ConA体外激活的脾脏淋巴细胞中提取mRNA,通过RT-PCR方法扩增和克隆了我国地方品种丝羽乌骨鸡IL-2cDNA,丝羽乌骨鸡IL-2基因由734nt组成,编码-由143个氨基酸组成的前体蛋白,基因5’端含有17个核苷酸和3'端含有285个核苷酸组成的非编码区,3'UTR中含有4个重复的“ATTTA”序列。编码蛋白氨基酸与Kestrel,Obese和SC品系的来杭鸡比较,氨基酸的突变主要发生在28-32位,这一区域丝羽乌骨鸡和Kestrel来杭鸡相同,Obese和SC鸡相同,基因系统进化树分析表明丝羽乌骨鸡和Kestrel来杭鸡具有很近的亲缘关系,Lbese和SC鸡具有很近的亲缘关系。中国的药用鸡品种-丝羽乌骨鸡在非常保守的133位发生了氨基酸突变,我们推测这可能与该品种鸡具有很强的抗病能力有关。     

鸡IL-2基因的克隆及GST-chIL2融合蛋白的表达

根据Sundick等发表的鸡IL-2基因(chIL2)序列设计合成特异性引物,用RT-PCR从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞扩增出450 bp的目的片段,酶切鉴定及序列测定结果表明为鸡IL-2基因。该基因包括鸡IL-2基因的全部开放阅读框,编码142个氨基酸组成的蛋白质,与GenBank鸡IL-2基因相比,在编码氨基酸的49位有一个氨基酸缺失;而与Broiler、SC、Chenren和Xiaoshan鸡在编码氨基酸上完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel来航鸡、来航SPF鸡、Obese、Silky和Xianju鸡等有1-4个氨基酸的差异;与火鸡和鹌鹑的氨基酸同源性分别为69.9%和59.4%。将克隆到的基因插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-6p-1中,得到重组表达质粒pGEX-IL2。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,表达出了大小约为40 ku的GST-chIL2融合蛋白,其中GST部分为26 ku,鸡IL-2为14 ku,与预期的鸡IL-2成熟蛋白大小一致。     

白来杭鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18（inteleukin 18,IL-18）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）基因序列,克隆白来杭鸡IL-18和GM-CSF基因并进行序列分析。结果显示：白来杭鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸,所获得的白来杭鸡IL-18基因与GenBank鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%。白来杭鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸,所获得的白来杭鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%-100%。IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性。IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点及3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点及4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。本研究结果为进一步研究鸡IL-18、GM-CSF基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

牛口蹄疫病毒受体通用亚基αv的基因克隆及分子特征

研究发现，4种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8能够介导口蹄疫病毒感染自然宿主，其中αv是4种受体的共用亚基。本试验对牛口蹄疫病毒受体通用亚基αv基因进行了克隆测序并对其编码蛋白的二级结构进行了预测。结果显示，牛αv亚基基因的编码区含有3147个核苷酸，编码1048个氨基酸，其中信号肽由30个氨基酸组成，胞外域由957个氨基酸组成，跨膜区由29个氨基酸组成，胞浆域由32个氨基酸组成；在890和891位氨基酸之间有1个蛋白酶裂解位点（KR-D）；胞外域含有13个潜在的糖基化位点（NXT／NXS）、2个Ca^2＋结合位点[DX（D／N）XDGXXD]、18个半胱氨酸残基。该基因在GenBank中的登录号为DQ871215。牛αv基因与猕猴、家鼠、犬、人、鸡的αv基因的核苷酸序列同源性分别为91．0％、85．7％、90．1％、91．2％、73．1％，推导的氨基酸序列同源性分别为94．7％、91．6％、96．3％、95．0％、81．6％。牛αv亚基存在复杂多变的二级结构，这是其具有多种生物学功能的分子基础，其中1-30位、988-1017位氨基酸区段疏水性较强，形成表面蛋白结构的可能性较差，分别是该亚基的信号肽和跨膜区。本试验为进一步深入研究口蹄疫病毒与宿主细胞的相互关系奠定了基础。     

白来航鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18(IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的序列设计2对特异引物,以白来航鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆白来航鸡IL-18和GM-CSF工基因并进行序列分析.测序结果表明,白来航鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡IL-18基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%.白来航鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%～100%,生物信息学分析表明,IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性,IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点,存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.     

鸭的类似鸡白细胞介素2基因的克隆及遗传进化分析

通过RT—PCR和DNA测序技术，克隆和测定了绍兴麻鸭的一种类似鸡白细胞介素2(IL-2)基因的核苷酸序列，并构建了该基因编码蛋白的三维结构分子模型。结果显示，绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因的核苷酸长度由748个碱基组成，编码产物为由140个氨基酸残基组成的多肽，编码产物中含有21个氨基酸残基组成的信号肽。绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因的核苷酸及编码产物，与鸡和火鸡IL-2的一致性分别为71.4％～72．1％和55．0％～57．9％，与哺乳类等动物IL-2的一致性分别为22．1％～28．8％和14．3％～17．1％。对绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因蛋白编码产物的系统进化树分析表明，其编码产物与鸡和火鸡IL-2具有较远的亲缘关系。绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因编码产物的三维结构，预测由4个α-螺旋结构和2个β折叠组成。这些研究结果预示。鸭的类似于鸡IL-2基因编码产物，在生物学功能上与哺乳动物和其他禽类具有很大的差异。     

大熊猫IL-4基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR技术从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明,克隆得到的IL-4基因开放阅读框由396个核苷酸组成,编码一个由132个氨基酸组成的多肽,包括编码24个氨基酸的信号肽和108个氨基酸的成熟肽。与GenBank中已登录的大熊猫IL-4（DQ166512）的核苷酸序列同源性分别为99.5%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的IL-4核苷酸同源性为50.7%（鼠）～87.7%（犬）;IL-4编码氨基酸同源性在35.7%（鼠）～78.8%（犬）;进化树构建结果表明,大熊猫与犬、猫遗传距离最近。     

海兰鸡白细胞介素-18全基因的克隆与序列分析

白细胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）是一种能诱导产生IFN-γ的新型细胞因子，在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列，自行设计一对引物，经植物血凝素（PHA）活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后，提取其总RNA，经反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增，扩增产物进行了T-A克隆、测序，获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列，其大小为597bp，与在GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现，中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致，为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

胸腺九肽对鸡脾淋巴细胞增殖转化及IL-2基因表达与分泌的影响

采用MTT比色法、相对半定量RT-PCR法和放射免疫测定（RIA）法研究了不同浓度的胸腺九肽对离体培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化、IL-2基因表达与分泌的影响。结果表明，用10ng／mL和lng／mL胸腺九肽处理鸡脾淋巴细胞8h后，能显著增加由ConA诱导的淋巴细胞增殖转化反应，显著提高IL-2基因的表达水平以及细胞培养上清液中的IL-2含量（P〈0．05）；100ng／mL的胸腺九肽虽有增强脾淋巴细胞增殖转化反应以及提高IL-2基因表达和分泌能力的趋势，但与对照组无显著差异（P〉0．05）。提示，胸腺九肽能增强鸡脾淋巴细胞的增殖转化反应，并主要在基因转录水平上促进IL-2的合成与分泌，其作用与弃3量大小有关。