猪瘟病毒NS23'端基因的克隆与原核表达

从真核表达载体pEGFP-NS2中克隆得到猪瘟病毒(CSFV)NS2 3'端的基因片段,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,克隆了大小为363 bp NS2 3'端的基因,重组载体pET-NS2-C363在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Weste...     

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。     

猪瘟病毒NS3丝氨酸蛋白酶功能区基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

用RT－PCR方法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和兔化弱毒株非结构蛋白NS3丝氨酸蛋白酶功能区[即NS3（△C）]基因cDNA，将之克隆到pGEM T载体测定其核苷酸序列，并出其对应氨基酸序列，结果表明这两个毒株间的NS3（△C）区基因核苷酸序列同源性为95.8%，氨基酸序列同源笥为99％，有2个残基的差异；两毒株与一些猪瘟病毒以及同属的牛病毒性腹泻病病毒代表毒株的对应序列进行比较，所测核苷酸序列及的氨基酸序列均极为保守，而且氨基酸序列分析结果还表明，瘟病毒NS3（△C）序列也含有与其它黄病毒同样保守的由His，Asp和Ser残基构成的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化三分体，三分体中Ser为丝氨酸蛋白酶催化活性关键氨基酸残基，将上述NS3（△C）基因亚克隆至原核表达载体pET-28a中，并在E.coli中获得高效表达，将表达产物纯化并免疫小鼠，间接免疫荧光和Western blot结果表明制备了针对NS3（△C）蛋白的多克隆抗体，上述实验结果为继续深入研究非结构蛋白NS3在猪瘟病毒的复制及病毒与宿主细胞相互关系中的作用，提供了基础材料及参考数据。     

猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达

参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的基因组序列，设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1—6中分别扩增出NS2长1389bp和876bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至表达载体pGEX—KG中，经酶切鉴定后，转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃，1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子量约为40ku处出现和预期的目的蛋白分子量相符的条带。Western—blotting检测表明，表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应，出现单一反应带，该表达产物主要存在于包涵体中。上述结果为NS2基因表达产物在免疫检测中的进一步应用奠定了基础。     

猪日本脑炎病毒NS3蛋白的基因克隆、原核表达及纯化

提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。     

流行性乙型脑炎病毒NS1基因克隆及其蛋白表达纯化

为了表达流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis type B）非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056 bp,以包涵体的形式表达约40 ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。     

禽呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术扩增了禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株与广西分离株R2 σNS非结构蛋白基因,将σNS基因克隆到质粒表达载体pGEX-4T-1上,获得的重组质粒经PCR、酶切鉴定以及测序分析,σNS基因的插入位置、大小和阅读框均正确,将阳性克隆命名为pGEX-S1133-σNS和pGEX-R2-σNS.构建好的重组质粒经37 ℃ 1 mmol/L IPTG诱导、SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,显示目的蛋白以包涵体方式表达,其蛋白质分子质量约为66.2 ku,约占菌体总量的31.5%～34.8%.Western-blotting分析表明,目的蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有较好的抗原性.     

猪瘟病毒E0蛋白的表达与抗原性研究

本研究采用PCR技术,扩增猪瘟病毒E0蛋白191～227氨基酸基因片段,将其克隆到表达载体pET-30C质粒中,获得重组质粒30C-E0-1725。经酶切、PCR、序列分析,证明插入的目的基因有正确的编码框架。Westernblot试验表明,利用大肠杆菌表达的目的蛋白,能与CSFV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原特异性。     

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因,然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点,将它们连接成为完整的Ｅ２基因,并克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重 质粒ＰＨＣＦ２。另设计一对引物,以ＰＨＣＦ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因,然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ＰＥＴ＿２８ａ（＋）中,获得重组质粒ＰＢＶＥ２和ＰＥＴＥ２,用酶切,ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及分子特性分析

为研究四川地区猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）及E2基因的遗传变异情况,试验对CSFV阳性病料抽提RNA,通过RT-PCR扩增CSFV E2基因并将其克隆到pMD18-T载体,经菌落PCR、双酶切、序列测定后利用生物信息学软件分析了E2基因的分子特性。结果显示,扩增的E2基因大小为1 125 bp,编码375个氨基酸,与GenBank中CSFV GXWZ02、CSFV/2.1、HEBZ、YC11WB、SXYL2006、0406/CH/01/TWN亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为98.3%、96.5%、94.7%、92.4%、92.1%和90.9%,而与疫苗株HCLV E2的同源性较低,为87.6%。密码子偏向性分析显示,E2基因的ENc值为53.161,密码子使用频率与大肠杆菌、酵母菌和人差异较大的分别有33、25和25个;此外,E2基因共有34个稀有密码子,且有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现。结果表明,E2基因在密码子使用中整体上不存在较明显的偏向性,且密码子使用模式更接近真核生物,本试验克隆的E2基因与疫苗株相比,部分核苷酸出现了变异,但主要抗原域氨基酸未发生改变,该结果为进一步开展CSFV E2功能研究及后期基因工程苗的研制提供了基础数据。     

RNA干扰抑制猪瘟病毒增殖的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、调控基因表达的监控机制,是存在于真核细胞内的一种自我保护现象。随着对RNA干扰机制的深入理解,其在病毒性疾病上的应用的研究也初显成效。作者概述了RNA干扰的作用机制及抑制猪瘟病毒增殖的研究现状,并提出了存在的问题和研究方向。     

抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定

将纯化后的猪瘟病毒免疫4只SPF级BALB/c小鼠,无菌取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经半固体培养基克隆化和间接ELISA筛选,最终获得了4株稳定分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。ELISA结果显示4株单克隆抗体效价均较高,并与其他病毒及PK-15细胞培养物无交叉反应。Western blotting结果证实3株单克隆抗体可特异性识别猪瘟病毒。间接免疫荧光试验可在细胞膜内观察到特异性绿色荧光,表明3株单克隆抗体与猪瘟病毒具有良好的反应性。该研究为猪瘟病毒新型诊断试剂开发奠定了基础。     

猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析

分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。     

猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0 μg/mL和1:200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37 ℃ 1 h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1:10 000和37 ℃ 45 min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。     

Development and Optimization of Indirect ELISA Detection Method of Classical Swine Fever Virus Antibody

In this study,through a series of screening and optimization of reactions condition,an indirect ELISA method was developed for detections the antibodies against classical swine fever virus (CSFV) with the purified recombinant CSFV E2 protein.The results showed that the optimal concentration for coating antigen was 1.0 μg/mL and incubated at 37 ℃ for 1 h.The proper serum sample was diluted by 1:200 and the sealing time was 37 ℃ for 1 h.Enzyme labeled second antibody was diluted by 1:10 000 and the reaction time was 45 min incubating at 37 ℃.The D450 nm<0.30 of sample defined as negative of CSFV antibody in the serum sample.The intra-batch and inter-batch variation coefficients were 4.8% and 6.9%,respectively.It indicated that the method in this study had a high stability.Specific test showed that the indirect ELISA had no crossing reactions with the antibodies against PRV,PRRSV,PCV and PPV.80 serum samples were detected in this study,the positive coincidence rate of indirect ELISA was 83.58%,the negative coincidence rate was 76.92%,and the total coincidence rate was 80.25% compared to the results of import blocking ELISA kit.The results suggested that the established indirect ELISA method in this study had an excellent clinical application.     

模猪场猪瘟野毒感染情况调查

利用ELISA方法对广西6个规模猪场送检的1626份猪血清进行猪瘟野毒感染情况调查。结果6个规模猪场均存在猪瘟野毒感染,其中母猪感染率为7.86%~29.21%,平均为17.52%,种公猪感染率为0%~23.52%,平均为11.83%,育肥猪感染率为5%~22.45%,平均为15.5%,断奶仔猪感染率为8.24%~18.57%,平均为12.69%。此检测结果与猪场临床发病情况基本一致,病猪多表现为繁殖障碍型、温和型的非典型猪瘟。     

猪瘟病毒多表位基因的表达及其免疫原性分析

体外表达猪瘟病毒(CFSV)T、B细胞表位,并对表达产物的免疫原性进行分析.人工合成CFSV的多个T、B细胞表位及表位之间的连接linker基因,并将该基因插入pGEX-6P-1表达载体,经酶切和测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了CFSV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pGEX-BT500,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,纯化表达产物并免疫兔.结果:通过IPTG诱导目的基因可高效表达,SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.9 mmol· L-1的IPTG进行诱导,7h后表达量最高,产物分泌表达,相对分子质量约43 ku,表达产量约占菌体总蛋白的30％.Western blotting检测表明,表达的融合蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应;兔攻毒试验表明所免疫表达产物可保护(根据发热反应评价)兔.结果表明表达获得的产物具有良好的反应原性,这为应用该融合蛋白制备CSFV免疫血清学诊断试剂和多表位疫苗研究奠定了基础.     

猪瘟病毒增殖特性研究进展

从猪瘟病毒在体内外的增殖特性、病毒蛋白在RNA复制中的作用两个方面对猪瘟病毒的增殖规律进行了阐述,以期为猪瘟病毒致病机理的研究提供参考。