对家蚕多星纹基因ms的SSR标记定位分析

对家蚕幼虫斑纹突变多星纹基因ms进行分子标记定位,有益于对多星纹性状的分子标记辅助选择和对该基因的定位克隆研究。利用家蚕雌性染色体在减数分裂过程中不发生交换的特点,采用幼虫斑纹为素斑(p)的家蚕品系C108,幼虫斑纹为多星纹(ms)的家蚕品系g02,组配正反交群体(g02×C108)F1♀×g02♂和g02♀×(g02×C108)F1♂,分别记作BC1F和BC1M,利用已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱中第12连锁群上的18对SSR标记引物在亲本间进行多态性筛选。BC1F群体中的普通斑个体均表现出与(g02×C108)F1相同的杂合型带型;而所有多星纹个体的带型与亲本g02一致,为纯合型。结果筛选出S1206、S1208、S1210、C5553S3共4个与家蚕ms连锁的SSR标记。利用BC1M群体构建家蚕ms及其连锁的SSR标记遗传连锁图,连锁图的图距为34.5 cM,4个SSR标记及ms的排列次序为S1206—S1208—S1210—C5553S3—ms,ms位于34.5 cM处,与ms最近的标记为C5553S3,遗传距离为12.4 cM。依据该SSR标记遗传连锁图谱可对ms进一步精确定位。     

家蚕裸蛹基因(Nd)的SSR定位

家蚕裸蛹是自然突变产生的,裸蛹基因(Nd)与丝素重链基因(Fib-H)同处于第25染色体上,二者紧密连锁。利用家蚕雌性不交换的特点,以家蚕正常茧品种P50和裸蛹品种Nd为亲本获得P50×(P50×Nd)和(P50×Nd)×P50回交群体(分别记为BC1M和BC1F),再用已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱对Nd基因进行定位,共筛选出7个与Nd基因连锁的SSR标记。BC1F群体中的所有裸蛹个体均表现出与(P50×Nd)F1相同的杂合型带型;而所有正常茧个体带型与亲本P50一致,为纯合型。利用另一个群体BC1M构建了Nd基因的遗传连锁图,连锁图的遗传距离为96.8 cM,Nd基因位于60.8 cM。同时得到了2个与Nd紧密连锁的SSR标记S2511及S2513,与Nd基因的距离分别为0.1 cM和1.1 cM。     

利用SSR标记对家蚕卵非胶着性基因(Ng)的定位分析

家蚕卵非胶着性基因(No-glue,Ng)位于第12染色体,Ng突变体的雌性成虫生殖器的粘液腺只分泌极少量的粘性物质,因此产下的卵不能粘着而成为天然散卵,是研究家蚕粘液蛋白分泌机制的重要材料。利用雌性家蚕的W染色体和Z染色体间不发生交换的特点,采用产胶着卵的家蚕品系KY和产非胶着卵的家蚕品系巴格达特(Ba)组配正反交群体(Ba×KY)F1♀×KY♂和KY♀×(Ba×KY)F1♂2种材料,分别记作BC1F和BC1M,根据已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱对Ng基因进行连锁分析及定位。BC1F群体中的所有产非胶着卵的个体均表现出与(Ba×KY)F1相同的杂合型带型;而所有产胶着卵个体的带型与亲本KY一致,为纯合型。筛选出4个与Ng基因连锁的SSR标记,并利用BC1M群体构建Ng基因的SSR标记遗传连锁图,连锁图的遗传距离为51.9cM,与Ng基因最近的引物为S1213,图距为0cM。     

利用SSR标记对家蚕耐氟基因进行连锁定位分析

采用家蚕耐氟品系T6和敏感品系733新组配正反交群体(733新×T6)×733新和733新×(733新×T6),分别记作BC1F和BC1M。基于雌性家蚕染色体不发生交换,用已构建的家蚕SSR连锁图上的标记对耐氟基因(dominant endurangce to fluoride,Def)进行了定位及连锁分析。在28个连锁群上都找到了多态标记,其中只有3个位于12连锁群上的SSR标记与耐氟基因连锁。根据第12连锁群上已有的微卫星序列,寻找其所在的Scaffold上的其它SSR位点,并设计引物,找到一个新的多态性SSR标记。BC1F群中的所有耐氟个体均表现出与(733新×T6)F1相同的杂合型带型,而所有敏感个体带型与亲本733新一致,均为纯合型,说明家蚕耐氟性状是由位于第12连锁群上单个显性主效基因控制的。利用另一个群体BCM构建了耐氟基因的遗传连锁图。     

家蚕AN品系的核型多角体病毒(BmNPV)抗性基因连锁与定位分析

不同家蚕品种对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的抵抗性存在较大差异。以对Bm NPV感染具有较强耐受性的家蚕品种华康2号杂交组合(F1)累代自交建立AN品系,以Bm NPV多角体悬液对该品系2龄起蚕经口添食的致死中浓度(LC_(50))为2.154×10~9m L~(-1),比对易感品系C108的LC_(50)提高了10~4倍以上。以易感品系C108作为回交亲本与AN品系组配F_1、BC_1、BC_2群体,2龄起蚕用浓度为1×10~8m L~(-1)的Bm NPV多角体悬液浸渍的桑叶饲喂12 h进行抗性遗传分析,表明AN品系对Bm NPV的高度抗性由位于常染色体的1个显性主基因控制。利用SSR分子标记和高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术对BC2F群体进行连锁分析,发现AN品系的Bm NPV抗性主基因位于第27连锁群。依据对BC2M定位群体的600余个个体的HRM分析结果,绘制了遗传总距离为29.1 c M的AN品系抗性主基因遗传连锁图,抗性主基因与S2800-9和S2801-352标记的遗传距离分别为5.2 c M、2.9 c M。通过对添食中等浓度(1×10~7m L~(-1))Bm NPV多角体悬液后存活个体的基因组DNA进行SSR分子标记HRM分析,推测家蚕抗性品系AN还存在多个分布于其他染色体的微效抗性基因。     

对家蚕第2隐性赤蚁基因(ch-2)的SSR标记定位及连锁分析

家蚕蚁蚕体色突变之一的第2隐性赤蚁(ch-2)有作为特殊遗传系统的实用价值。采用家蚕正常黑蚁品种P50和第2隐性赤蚁品种k04为亲本组配正反交群体,回交后获得回交群体(k04×P50)×k04和k04×(k04×P50),分别记作BC1F和BC1M,基于雌性家蚕的W与Z染色体不发生交换的特点,用已构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱对ch-2基因进行定位和连锁分析。在第18连锁群上的20个多态性标记中共筛选出7个与ch-2基因连锁的SSR标记。根据第18连锁群上已有但不表现多态性的微卫星序列,寻找其所在Scaffold上的其他SSR位点并设计引物,结果找到2个新的多态性SSR标记。BC1F群体中的所有黑蚁个体均表现出与F1(k04×P50)相同的杂合型带型,而所有赤蚁个体带型与亲本k04一致,为纯合型,说明家蚕ch-2基因位于第18连锁群。利用另一个群体BC1M构建了ch-2基因的SSR分子标记遗传连锁图,连锁图的遗传距离为70.7cM,ch-2基因位于69.6 cM处。2个与ch-2最近的SSR标记为S1814和S1819,与ch-2的距离分别为7.9、1.1 cM。     

家蚕scaffold中新微卫星标记的获得与Dll基因的遗传连锁分析

在进行家蚕遗传连锁图谱的整合过程中,需要寻找两个作图群体中都有多态的共有标记,但这种共有标记数量较少。为此,利用已有的简单重复序列(SSR)与家蚕基因组进行比对,寻找到匹配的scaffold,再采用SS-RHunter1.3搜索其中的SSR区域,排除掉原有SSR序列,选择重复次数在6～23之间的微卫星区域设计引物,用BC1群体的亲本及F1进行多态性的筛选,选择有多态性的标记用7019×(F50B×7019)BC1群体进行基因型分析。结果显示:根据原家蚕第2连锁群上SSR位点新设计的邻近的7对引物中,有6对引物在BC1群体的亲本中有多态性,选择其中2个进行遗传连锁分析,作图结果与原有相应SSR标记的作图结果基本保持一致,其中根据S0207所在scaffold上开发的NS02071和NS02072之间的图距达到6.9 cM;根据家蚕大造和C108的回交一代初步定位的D ll基因的位置与后来在其所在scaffold上所设计的临近引物D ll1和D ll2的定位一致,且这两个标记在遗传连锁图上的图距为0.0 cM,表明这两个标记在遗传图上的位置重叠。由此,在较短的DNA区域内(在遗传连锁图上表现1个位点)便有多个SSR标记可供使用,将为定位家蚕重要经济性状基因、分子辅助育种及功能基因研究等提供更多有价值的信息。     

家蚕黄茧近等基因系SSH文库的构建及部分EST序列分析

以家蚕黄茧品系KY(YYCC)和白茧品系C108(+Y+Y+C+C)组配黄茧(C)近等基因系。挑取回交11代的黄茧(C)近等基因系群体中的黄血个体的黄色和浅黄色中部丝腺作为实验材料,构建家蚕黄茧近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。通过对SSHcDNA文库中随机挑选的104个阳性克隆测序和聚类拼接,得到15个假定基因(contig)、25个已知功能基因(unigenes)和5个未知功能基因(unknown)。获得的表达序列标签(EST)经Blast比对和同源性分析,初步发现这些基因参与家蚕体内能量代谢、基因转录、信号传导、物质转运、细胞生长分裂、细胞结构形成、蛋白质合成与降解、核酸及蛋白质加工、机体防御等诸多生物学过程。分析结果可作为深入研究家蚕茧着色分子机制的基础信息。     

家蚕黄血近等基因系SSH文库的构建及部分EST的序列分析

以家蚕黄血品系KY和白血品系HB构建家蚕黄血近等基因系。用回交18代的家蚕黄血基因(Y)近等基因系群体中的黄血个体和白血个体中肠为材料,构建了家蚕黄血近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。从该抑制消减杂交cDNA文库随机挑选出46个阳性克隆进行测序,并用CAP3软件聚类拼接,得到4个假定基因(contig)和9个已知功能基因(unigenes)。通过BLAST比对和对所得表达序列标签(EST)的同源分析表明,这些基因主要涉及能量代谢因子、RNA分子水平相关调节因子、酶类、结构蛋白等,由此初步探明了参与黄血基因(Y)协同作用的相关基因表达蛋白的种类和数量,可为进一步研究蚕茧着色的分子机制及通过遗传选择培育天然有色茧品种提供基础信息。     

玉米胚乳突变基因ae连锁累赘的SSR分析

本研究通过与玉米胚乳突变基因ae连锁的SSR标记对轮回亲本不同的2个回交一代群体amylose extender(ae)基因两侧的连锁累赘进行了SSR分析.通过均匀分布在ae基因所在的Chr5连锁群上的SSR标记对这2个回交群体的染色体遗传背景回复率开展研究,结果表明,通过MAS可以将回交群体CHBC1F2染色体两侧的连锁累赘分别限定到13.2和17.2 cM,将另一回交群体DHBC1F2的染色体的单侧连锁累赘限定到13.9 cM.背景选择的结果表明,通过基因组的负选择可以使CHBC1F2群体中某些植株的5号染色体的遗传背景回复率达到85.7%,使DHBC1F2群体的染色体的遗传背景回复率达到87.5%.通过高密度的遗传连锁图谱(比如10～20 cM)就可以直接选择在目的基因附近发生重组的个体,减少不需要的染色体片段,降低目标基因附近的搭载效应.     

家蚕蛾黄翅的遗传分析与黄血基因的多效作用

在保存家蚕突变基因资源过程中调查发现：黄血蚕蛾翅在羽化之初呈鲜黄色,白血蚕均不然。通过与白血蚕（非黄翅）和黄血抑制基因（I）进行杂交试验,分析黄翅的遗传规律,结合普查家蚕突变系统蛾翅色性状,证明黄翅性状与幼虫黄脚一样,为黄血基因支配。进而记录了因黄血基因的多效作用在卵、幼虫、茧、成虫各阶段表现的形态特征。     

家蚕绿色茧品种G_1的茧色性状遗传及不同茧色蚕体组织的黄酮类化合物含量分析

为了探究绿茧系家蚕品种的茧色性状遗传规律,以家蚕绿茧品种G1和白茧品种C108为亲本,配制正反交F1及其自交F2和回交代等多种群体材料,茧色分离调查结果显示:F1为浅绿色茧;自交F2呈现白色茧∶浅绿色茧∶绿色茧=1∶2∶1的分离比;回交后代(C108×G1)×G1、G1×(G1×C108)均呈现绿色茧∶浅绿色茧=1∶1的分离比,而C108×(G1×C108)呈现白色茧∶浅绿色茧=1∶1的分离比。此结果说明家蚕品种G1的绿茧性状对白茧性状为不完全显性遗传。家蚕绿茧系的显色物质为黄酮类化合物,分析不同茧色蚕体组织中的黄酮类化合物含量是研究色素代谢与绿色茧呈色机制的重要途径之一。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法,测定亲本绿茧品种G1、白茧品种C108和(G1×C108)F1的幼虫中肠、血液、丝腺组织在整个5龄期的黄酮类化合物含量以及茧层中的黄酮类化合物含量,结果显示:3种茧色个体的中肠组织的黄酮类化合物含量无明显差异,推测其合成黄酮类化合物的能力相当;中肠组织与血液中的黄酮类化合物含量与茧色没有明显关系;丝腺组织和茧层中黄酮类化合物含量以G1最高,(G1×C108)F1居中,C108最低。此结果说明绿茧色的深浅与丝腺和茧层中的黄酮类化合物含量表现出良好的一致性。     

黄血抑制纯合系白银的选育初报

从欧系品种中筛选出黄血抑制基因 ,并将其导入皮斑限性实用蚕品种 871中 ,选除不良基因 ,经纯合固定 ,得到综合性状优良的皮斑限性黄血抑制纯合系统 ,命名为白银 (♀IIW+p, IIZZ)。在茧形上 ,一方偏中系选择 ,另一方偏欧系选择 ,分别建立白银A 系及白银B 系。与限性黄茧 (♀iiWYZ , iiZZ)对交 ,F1代全为白茧 ,有望使限性黄茧实用化