“Y—DNA特异片段的PCR技术鉴定牛和绵羊胚胎性别及生产应用”课题成果通过鉴定

中国农业科学院畜牧研究所繁殖室与农业部动物检疫所生物技术室合作,经过3年研究,已完成“应用 Y—DNA 特异片段的PCR 技术鉴定牛和绵羊胚胎性别及生产应用”课题。经农业部核准并委托北京农业大学主持,于1992年7月22日,通过了成果鉴定。该研究应用删除富集法构建富含牛和绵羊 Y—DNA 文库。筛选出特异克隆,并根据其序列,设计和合成引物。在实验室,用已建立的 PCR 检测技术,分别对已知性别的11只绵羊和10头牛的血样进行了检测,检测结果与实际性别完全一致。在生产现场,建立了简易、可行胚胎细胞取样技术和防止污染的措施。经性别鉴定的奶牛胚胎,移植     

应用PCR技术鉴定牛早期胚胎性别的研究

应用ＰＣＲ技术鉴定牛早期胚胎性别的研究吕碧文俞颂东金水仙（浙江省农科院畜牧兽医所,杭州,３１００２１）家畜胚胎的早期性别鉴定技术,是家畜胚胎移植技术的一项重要内容,其实质就是Ｙ染色体或存在于Ｙ染色体上的性别决定基因（即ＳＲＹ基因）的检测技术。ＰＣＲ...     

应用PCR技术鉴定牛早期胚胎性别方法优化的研究

研究的目的是优化胚胎PCR性别鉴定方法的条件，建立实用的鉴定方法。试验设计获得了牛种属和公牛特异的引物，利用聚合酶链反应（PCR）对模板DNA进行扩增，通过常规双重PCR法和巢式PCR法的比较研究，结果表明巢式PCR法大大提高了鉴定牛早期胚胎性别的灵敏度。对组织DNA样品、血样、颗粒细胞和公牛冷冻精子进行检测，结果全部与实际性别一致；对于胚胎样品，判定结果与产犊性别一致。通过批量胚胎现场的检测，证明建立的胚胎性别鉴定方法可用于生产。     

应用PCR技术鉴定奶牛胚胎性别的研究

目前胚胎性别鉴定方法很多,已经报道的方法有:进行染色体核型分析的细胞遗传学方法;H-Y抗血清识别胚胎表面H-Y抗原的免疫学方法;利用Y染色体片段制作核酸探针的杂交法等.这些方法由于都有准确率不高、费时,或不适于应用到实际生产中等缺点而难以推广.进入20世纪80年代后,SRY基因的发现及PCR技术的应用,为性别鉴定提供了新的思路.     

用PCR鉴别牛胚胎性别的研究

本试验建立了用聚合酶链反体外扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列鉴别牛胚胎性别的方法。选择３头成年健康西门塔尔母牛为供体，在其自然发性后第９～１４ｄ，用ＦＳＨ超排处理，人工授精，发情后的第７ｄ（发情日为０ｄ），用非手术法采集胚胎，共获得１１枚Ａ．Ｂ级胚胎。在立体显微镜下分别对胚胎进行分割，各获得２个半胚。一个法胚在２０μＬ含１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ，２ｍｏ     

Mg^2＋浓度对PCR技术鉴定牛早期胚胎性别的影响

应用聚合酶链反应技术鉴定牛早期胚胎性别时,反应缓冲液中Ｍｇ＾２＋的浓度应选择高于常规ＰＣＲ的２５ｍＭ浓度,在较低浓度时均无产物形成,只有在较高浓度时才有扩增,引物Ｃ才能较好地与相对应的Ｙ染色体上的特异性ＤＮＡ邓列结合,退火,形成正确的ＰＣＲ产物,即ＳＲＹ基因,从而保证了鉴定结果的科学性和精确性。     

PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

早期胚胎性别鉴定的方法有很多种,大致可分为两大类：一是前期主要采用的非生物学方法,如组织方法,免疫学方法[~[p16]〔1〕],X-相关酶法[~[p16]〔2〕]等,这些方法都缺少准确性和速度;二是80年代末,随着DNA体 外重组技术而发展起来的分子生物学方法,如DNA探针法〔3〕,聚合酶链反应法（PCR）。其中PCR法以灵敏、特异、准确和快速等特点,而成为胚? 胎性别鉴定中最有研究价值的技术方法。自Herr等（1990）[~[p16]〔4〕]报道了用PCR进行奶牛胚胎性别鉴定技术之后,国内外许多学者从事了这方面的研究 ,使准确率接近或达到了[=]100%,同时操作过程也简化了许多,并且可以在几个小时内完成,为PCR法进行早期胚胎性别鉴定应用于生产提供了基础。     

牛早期胚胎的性别鉴定PCR技术的研究

根据牛SRY(Y-染色体性别决定基因)基因序列自行设计合成3对常规PCR引物作为牛性别鉴定特异性引物,对15头公牛、20头母牛的样品进行检测.结果表明,第2对引物可清晰扩增出公牛基因组DNA750 bp左右条带,而母牛基因组DNA无此扩增条带,证明这条引物可以应用于牛的早期胚胎性别鉴定研究与应用.     

PCR方法鉴定牛早期胚胎性别研究进展

对用于早期胚胎性别鉴定的多重PCR、巢式PCR、引物一扩展预扩增PCR、非电泳PCR和LAMP法等扩增技术进行了综述,并针对早期胚胎性别鉴定技术在养牛业生产中的应用现状和存在问题进行分析与讨论,展望了PCR性别鉴定技术在养牛业中广阔的商业应用前景。     

PCR技术在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

牛早期胚胎的性别鉴定已有十几年的发展历史,从早期的免疫学方法到胚胎细胞的染色体核型分析,取得了巨大的进展,但真正进入实用化阶段是PCR技术在牛早期胚胎性别鉴定中的应用.     

鉴别牛早期胚胎性别PCR方法引物的设计与筛选

根据牛Y-染色体特异重复序列、睾丸特异蛋白基因以及性别决定基因序列设计合成5对公牛Y-染色体特异引物，依据牛骨胳肌α肌动蛋白前体基因和微卫星DNA序列设计合成4对牛DNA特异引物(内标引物)。单重PcR扩增牛基因组DNA，筛选出4对牛Y-染色体特异引物和1对牛DNA特异内标引物。将不同的Y-染色体特异引物与内标引物组合，多重PCR扩增牛基因组DNA、已知性别的牛成纤维细胞和克隆胚胎，筛选出2个可用于牛早期胚胎性别鉴别的PCR引物组合：B34／A12和B78／A12。     

Experiences of Using PCR for Sexing Bovine Embryos*

Bovine embryos were used to evaluate the accuracy and the efficiency of sexing embryos by amplifying male specific DNA using the polymerase chain reaction. Blind tests with biopsies and biopsied embryos suggested that the method is accurate. However, often the amplification was unsuccessful and the assay therefore uninformative. We were able to amplify male specific DNA from degenerated embryos as well as from embryos stained with Hoechst 33342.     

牛胚胎性别鉴定荧光定量PCR方法的优化与应用

旨在建立一种可检测牛早期胚胎性别的复合探针体系,减少常规PCR方法电泳所带来的污染,提高鉴定准确率,降低鉴定成本.本研究以SRY为牛胚胎性别鉴定的目标基因,以进口YCD-PCR性别鉴定试剂盒为对照组(n=9543),荧光定量PCR的单引物分别扩增体系(荧光单扩,FSPSA,n=6570)和双引物混合扩增体系(荧光双扩,...     

切割取样后胚胎的冷冻保存技术的研究

研究了切割取样后小鼠胚胎和牛胚胎冷冻-解冻的技术方法。结果表明：（1）分别以10％甘油、10％乙二醇作为冷冻液以及在以上两种冷冻液中分别添加10％葡聚糖＋0．1mol／L蔗糖作为冷冻液常规方法冷冻切割后的小鼠胚胎，冷冻-解冻后体外培养72h总发育率分别为56．9％（259／455）、81．8％（604／738）、84．8％（540／637）和59．5％（308／518）。（2）取样后胚胎体外短暂培养（0-4h）并不能提高切割取样后小鼠胚胎冷冻-解冻体外培养发育率。（3）切割取样小鼠胚胎在25％甘油＋0．25mol／L蔗糖＋20％的血清为冷冻液，在-100～-110℃左右熏蒸2min快速冷冻后体外培养发育率为73．3％（33／45），切割取样牛胚胎快速冷冻-解冻移植妊娠率为57．1％（4／7）。     

牛早期胚胎性别快速鉴别的研究

根据聚合酶链式反应中聚合酶的扩增特性,对PCR反应的循环参数进行研究,取消了PCR反应中延伸这1温度梯度,对2温度梯度PCR方法进行了单重PCR和多重PCR扩增研究,并采用2温度梯度多重PCR方法分别对牛基因组、成纤维细胞、胚胎样品进行了性别鉴别研究,建立了稳定、简便、快速的用于牛早期胚胎性别鉴别的2温度梯度PCR方法.同时还对2温度梯度PCR的扩增能力进行了研究,结果表明：2温度梯度PCR方法能够扩增片段的可能长度为633 bp.     

利用分离的奶牛X精子冷冻精液生产体内性控胚胎试验

采用常规精液和分离的X精子冷冻精液对115头超数排卵的青年和经产荷斯坦母牛人工输精生产体内性控胚胎。结果表明,利用2支和3支性控精液给超排青年母牛输精,头均分别获得6.8枚±4.8枚和6.3枚±3.2枚可用胚胎,与常规精液的超排效果(7.2枚±5.2枚)无明显差异;利用2支和3支性控精液给超排经产母牛输精,头均可用胚胎分别为7.5枚±4.5枚和8.6枚±5.6枚,与常规精液的超排效果(6.1枚±3.2枚)相比,分别增加23%(P>0.05)和41%(P>0.05),无显著差异,但解冻后性控精子会明显影响经产母牛的受精率;对用性控精液输精生产的12枚抽样胚胎采用LAMP法进行性别鉴定并移植,结果获得了91.7%的雌性率和36.4%的受胎率。结果提示,X精子的分离过程会在一定程度上影响受精率,用分离的X精子冷冻精液对超排母牛进行人工授精生产体内性控胚胎是可行的。     

PCR法鉴别牛早期胚胎性别的研究进展

对PCR法鉴别动物胚胎性别的机理进行了分析,综述了近10年来相关操作技术的进展,包括早期胚胎取样、胚胎细胞DNA的提取、引物的设计、扩增条件的优化、扩增产物的检测和性控胚胎的冷冻等,并提出PCR法鉴别牛早期胚胎性别的前景与展望。     

性别鉴定后胚胎移植妊娠率影响因素分析

对影响后的性别鉴定胚胎移植妊娠率的因素进行了分析。结果表明,性别鉴定胚胎的鲜胚和冻胚移植妊娠率均低于非性别鉴定胚胎,但二者差异不显著(P>0.05),这表明性别鉴定胚胎在生产中应用是可行的。随着胚胎细胞取样数的增多,其移植妊娠率逐渐下降,且冷冻带来的损伤明显增大;性别鉴定胚胎在体外放置时间小于5 h的妊娠率比大于5 h的高,且差异极显著(P<0.01);性别鉴定胚胎移植时受体的最佳移植时间在发情后的7.5~8.5 d;繁殖力好的受体牛移植妊娠率比繁殖力差的受体牛移植妊娠率高,且差异极显著(P<0.01)。     

Sex Determination of Bovine Embryo Biopsies Using in situ Hybridization*

A male specific bovine DNA fragment was used as probe to determine the sex of bovine interphase cells by in situ hybridization. This method also proved useful for determining the sex of bovine embryos.     

Isolation of Y Chromosome-specific Sequences and their Use in Embryo Sexing*

Y chromosome-specific sequences derived to date from cattle, sheep and pigs are described. The methods used to isolate these sequences and possible future approaches are discussed. Three different techniques of sex determination are described: in situ hybridisation, Southern/Dot blotting and PCR based assays. All three methods utilise Y chromosome-specific sequences. Necessary controls and precautions for PCR mediated assays are discussed.