5种家蚕病毒的密码子及密码对使用模式分析

通过分析5种家蚕病毒基因组密码子和密码对使用模式,初步探讨5种家蚕病毒的基因组进化和对宿主的适应策略。采用生物信息学方法对碱基含量(GCall、GC1、GC2、GC3、GC3s)、有效密码子数(ENc)、相对同义密码子使用度(RSCU)、密码对(codon-pair)等进行统计分析的结果表明:5种家蚕病毒的密码子偏好性均较低,病毒间的碱基组成及ENc值差异较小,碱基组成对密码子使用模式影响较小;不同病毒选择不同的偏好性密码子,不同病毒的密码对偏好性程度不同,其中,家蚕类葡萄斑点病毒(Bombyx mori macula-like virus,BmMLV)密码对偏好性最强,家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)密码对偏好性最弱。聚类分析表明BmCPV和家蚕浓核病毒(Bombyx mori densovirus,BmDNV)的密码子使用模式相似,BmNPV和家蚕传染性软化病病毒(Bombyx mori infec-tious flacherie virus,BmIFV)的密码子使用模式相似;BmMLV、BmNPV和BmDNV的密码对使用模式相似,BmIFV和BmCPV的密码对使用模式相似。5种病毒的偏好性密码子和偏好性密码对不同,显示不同病毒的密码子和密码对的进化路径不同,对宿主的适应策略不同。     

牦牛部分功能基因密码子偏好性的聚类分析

本文利用系统聚类法对牦牛部分功能基因进行了密码子偏好性的聚类分析,并同普通牛和猪的相关基因作了对比。结果表明:不同物种间,类型或功能相似的基因具有相近的密码子偏好性;三个物种的基因在类型或功能上的差异决定了其密码子使用偏好性的聚类结果;在功能或类型相近的前提下,物种间的差异在一定程度上决定了密码子使用的偏好性。     

口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

哺乳动物低氧适应性基因EGLN1的密码子偏好性与聚类分析

为了研究哺乳动物低氧适应性基因EGLN1的密码子偏好性和进化关系,试验采用多种分析软件对18种哺乳动物的EGLN1基因进行了分析。结果表明:18种哺乳动物共同偏好使用的密码子有7个,藏羚羊和山羊偏向使用以A或U结尾的密码子,其余物种均偏向使用以G或C结尾的密码子。EGLN1基因在不同物种编码时偏好使用的密码子存在差异;AGU、CUU、CCA、GCU是野牦牛、藏羚羊、山羊共有的偏好性密码子;UCU、AGU、CUU、CCA、GCU、GAA、GCU是藏羚羊、山羊共有的偏好性密码子;CCA、GCU、AAA是藏羚羊、马共有的偏好性密码子;这些密码子主要在野牦牛、藏羚羊、山羊、马中偏好使用,在其他物种中使用较少。野牦牛对编码Tyr、Cys的密码子没有偏好性,藏羚羊、山羊对编码Asn的密码子没有偏好性。基于EGLN1基因密码子偏好性的聚类与基于EGLN1基因CDS序列的分类结果不完全一致,总体上亲缘关系相近的物种密码子偏好性差异小。说明密码子使用的偏好性可以作为物种分类的一种指标。     

籽粒苋叶绿体基因组密码子偏好性分析

对筛选出的47条籽粒苋叶绿体基因组蛋白编码序列的密码子使用偏性特征进行分析,结果发现:籽粒苋叶绿体基因组密码子第3位碱基GC的含量较低,为27.31%,即第3位密码子富含A和U;有效密码子数(ENC)值在35.25～61.00之间,基因组中多数蛋白编码序列的密码子使用偏好性偏弱。相对同义密码子使用度(RSCU)分析表明,有29个密码子的RSCU1,其中密码子第3位碱基以A、U结尾有24个,表明密码子的第3位碱基使用偏好于A和U。中性分析发现,GC_3与GC_(12)相关性显著,回归曲线斜率为0.403,表明突变对密码子偏性有极大影响;ENC-plot分析发现,大部分基因落在标准曲线及其附近,表明自然选择也一定程度上影响了密码子偏性。进一步的对应性分析发现,第一轴显示了22.98%的差异,为主要影响因素,其与ENC值的相关性达到显著水平,但与GC_3、CBI、GC_(all)相关性不显著。综合分析表明,突变是影响籽粒苋叶绿体基因组密码子偏好性的主要因素,但其他因素也可能有一定影响;UUU、UUA、UCU等24个密码子为最优密码子。     

基于自动饲喂系统的鸡采食地点偏好性及其与单次采食性状关系的研究

为研究鸡群在采食过程中对采食地点是否具有偏好性,以及鸡偏好性行为与单次采食性状的关系,试验通过鸡自动饲喂系统收集的采食数据,计算各测定站日利用率、累计饲料消耗量、日进入鸡只数和日采食次数,将其作为鸡只采食地点偏好性的量化指标,并通过比较测定站日利用率高低组的鸡只单次采食时长、单次采食量、单次采食速率的差异来反映鸡采食地点偏好性与采食行为的关系。结果表明:鸡群在采食过程中对采食地点存在偏好性,采食地点偏好性主要与特定地点发生的采食鸡只数、采食次数、单次采食速率、单次采食量相关。研究结果为后续鸡只采食行为相关研究和养鸡生产提供了科学依据。     

扁蓿豆叶绿体基因组密码子偏好性分析

为阐明扁蓿豆（Medicago ruthenica）叶绿体基因组密码子使用模式，以其50条蛋白编码序列（CDS）为对象，利用软件CodonW 1.4.2、Excel以及在线程序对其ENC，RSCU，GC含量、中性绘图、PR2-plot、最优密码子等进行分析得到以下结果：基因组平均GC含量为40.58%，其中GC1>GC2>GC3；ENC的取值介于35.77～56.62之间，表明密码子使用偏好性较弱；基因组中共有30个密码子RSCU>1，其中29个以A/U结尾；ENC-plot绘图分析结果中多数基因分布于标准曲线下方，22个基因ENC比值在—0.05～0.05之间，密码子偏好性主要受选择影响；PR2-plot分析表明碱基T的使用频率大于A，G大于C，说明密码子偏好性还受其他因素影响；该基因组中共有UUU，UUA，ACU等11个最优密码子并均以A/U结尾。以上研究结果可为扁蓿豆叶绿体基因组优良基因利用提供理论与基础。     

多杀性巴氏杆菌的遗传密码子偏好性初步分析

为了研究多杀性巴氏杆菌的遗传密码子偏好性,试验以GenBank中登录的27条多杀性巴氏杆菌功能基因的CDS序列为材料,利用CodonW软件初步分析了多杀性巴氏杆菌密码子的偏好性。结果表明:UUU、UUA、CUU、AUU、GUU、GUA、UCU、UCA、AGU、AGC等28个密码子为多杀性巴氏杆菌的偏好性密码子。     

昆虫共生菌沃尔巴克氏体(Wolbachia)的wsp基因密码子使用模式分析

沃尔巴克氏体(Wolbachia)主要感染昆虫等节肢动物,是一类革兰阴性共生细菌。为探讨昆虫纲共生菌Wolbachia的系统发育,研究Wolbachia基因组中进化速度较快的外膜蛋白基因wsp的密码子使用模式及影响因素,统计分析该基因的GC含量(GCall、GC1、GC2、GC3、GC3s)、有效密码子数(ENc)、相对同义密码子使用度(RSCU)等指标。结果显示:昆虫纲共生菌Wolbachia的wsp基因密码子偏好性均不强,昆虫纲不同目间共生菌Wolbachia的wsp基因碱基组成及ENc值差异较小;多数基因数据点沿标准曲线或在其附近分布,突变对碱基组成的影响较弱;18种由多个密码子编码的氨基酸中有11种氨基酸的偏好性密码子在昆虫纲7个目及对照蛛形纲1个目间均相同,有2种氨基酸的偏好性密码子在7个目间相同,这些密码子均以A/U结尾;供分析的140个wsp基因中仅编码6个半胱氨酸(Cys);对应分析中第1、第2向量轴贡献率均不高,分别为13.53%和12.49%,均与碱基组成(GC1、GC2、GC3)显著相关。综合各项分析认为,Wolbachia的wsp基因密码子偏好性不具有宿主分类特异性,密码子使用模式主要受碱基组成影响,而碱基组成主要受选择影响。     

亚洲带绦虫基因组密码子使用偏性分析

为了解亚洲带绦虫基因组的密码子用法及影响密码子使用模式的主要因素,以亚洲带绦虫基因组注释的13 323条CDS序列为数据来源,利用CodonW软件对其密码子碱基组成、有效密码子数(ENC)和同义密码子相对使用频率(RSCU)各项指标进行统计分析。结果显示:(1)从亚洲带绦虫基因组数据中筛选获得11 203条CDS序列,平均长度为1 386 bp, GC含量在25.9%～74.1%之间,变化范围较大;(2)同义密码子第3位出现G或C的频率为50.11%,比出现A或T的频率高;(3)有效密码子数介于20.64～61.00,平均为51.06;(4)ENC-plot分析、中性分析、PR2分析及相关性分析结果表明,影响亚洲带绦虫密码子使用偏性的因素除了突变和选择两种力量外,还包括GC含量、基因长度、蛋白质的亲水性和芳香度;(5)最终共有25个密码子被确定为最优密码子,绝大部分以G或C结尾。结果说明,亚洲带绦虫基因组中大部分基因密码子使用偏性较弱,仅少部分基因具有较强偏性,偏好使用以G或C结尾的密码子,且这一现象是由突变、选择、碱基组成等多重因素共同作用形成的,该结果为进一步研究该物种遗传背景和分子进化提供了一定的科学依据。     

A case of a canine pigmented plaque associated with the presence of a Chi-papillomavirus

The seven fully described canine papillomaviruses (CPVs) have been allocated by sequence comparison and other genetic features into three phylogenetic clades. This largely reflects clinical findings, so each sequence of a newly discovered CPV in combination with clinical and pathological details is a valuable piece of evidence. We hypothesize that the genomic sequence of a new CPV can help to predict clinical features and progression, and that this can be tested in subsequent cases. In this case, a 2-year-old female dachshund-mix presented with papillomatosis clinically and histologically characterized as pigmented viral plaques. PCRs using primers evaluated for CPVs successfully amplified papillomavirus (PV) DNA. Sequencing of the products revealed an unknown PV putatively belonging to the PV genus Chi. Rolling circle amplification was used to amplify the entire viral genome. Sequencing revealed a novel PV, designated as CPV8, which was most closely related (63% homology) to the recently discovered CPV4. CPV4 is associated with benign pigmented plaques in pugs. Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequences of four viral genes showed that the novel virus was closest to CPV3, CPV4 and CPV5. The presence of viral DNA was confirmed in the lesions by in situ hybridization using specific probes. CPV8 may consequently be regarded as the fourth member of the Chi-papillomavirus genus. All viruses belonging to this genus induce pigmented plaques in dogs. These findings support the hypothesis that genomic sequences can be useful in predicting the clinical features of CPV infection.     

Detection and molecular epidemiology of canine parvovirus type 2 (CPV-2) circulating in Jilin Province,Northeast China

Canine parvovirus (CPV) is highly contagious and can cause haemorrhagic enteritis and myocarditis in dogs. To understand the current epidemic situation of CPV in Jilin Province, China, a total of 44 fecal or intestinal tissue samples of pet dogs suspected of being infected with CPV from February 2018 to November 2019 in Changchun and Liaoyuan City, Jilin Province were collected.All of the 44 collected samples were tested positive to CPV-2 by a PCR assay. The sequencing and analyzing of complete VP2 genes showed that CPV-2c was the most prevalent variant (n = 31;70.4 %), followed by new-CPV-2a (n = 8;18.2 %), new-CPV-2b (n = 4; 9.1 %) and CPV-2 (n = 1; 2.3 %). Phylogenetic analysis revealed that the 31 CPV-2c strains in our study are closely related to local CPV-2c isolates in cluster I. The VP2 protein of the acquired CPV 2c strains all possessed the substitutions Ala5Gly, Phe267Tyr, Tyr324Ile, and Gln370Arg only one with a novel Arg481Lys mutation. These findings demonstrate that CPV-2c was the most prominent type of CPV circulating in Jilin in 2018–2019, clustered in a separate group that is far from the vaccine strains and suggest that further and extensive epidemiological investigation among pet dogs are warranted to provide information for usage and research of current vaccines.     

犬细小病毒四川株的分离与鉴定

采集5份患出血性肠炎犬的粪便,通过猫肾细胞(F81)传代培养后,成功分离到2株病毒。对2株病毒进行病毒形态学、理化学、血凝试验、PCR鉴定与分子生物学系统鉴定后,证实分离株是犬细小病毒,通过VP2结构蛋白测序分析表明,新分离到的2株细小病毒抗原型分别属于CPV-2a和CPV-2b。     

犬细小病毒四川株的分离与鉴定

为更好地了解我国细小病毒流行情况,笔者从四川农大动物医院采集5份患出血性肠炎犬的粪便,通过猫肾细胞(F81)传代培养后,成功分离到两株犬细小病毒。对两株病毒进行病毒形态学、理化学、血凝试验、PCR鉴定与分子生物学系统鉴定后,证实分离株是犬细小病毒,通过VP2结构蛋白测序分析表明,新分离到的两株细小病毒抗原型分别属于CPV-2a和CPV-2b。     

Isolation and Identification of Canine Parvovirus Virus and Sequence Analysis of VP2 Gene

A strain of virus was isolated and identified from feces of a suspected canine parvovirus (CPV) infected dog.It was eventually identified as CPV using electron microscope examination,hemagglutination (HA) test,animal regression experiment and molecular biology idenfication,designated as BJ-24 strain.The VP2 gene sequence analysis of BJ-24 strain showed that BJ-24 strain belonged to CPV-2a subtype.The analysis of VP2 gene indicated that the BJ-24 VP2 gene shared higher homology of nucleotide with 19 CPV strains available in GenBank and were more than 98.7%.The highest homology was 100.0% with CPV-JS2 strain.Phylogenetic tree analysis showed that BJ-24 strain belonged to China cluster and there was the closest distant between BJ-24 strain and CPV-JS2 strain.This study provided the basic evidence for further study on molecular epidemiology in Beijing and laid the solid foundation for developing vaccine and preventing the spread of CPV.     

Detection of canine parvovirus in fecal samples using loop-mediated isothermal amplification.

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel, sensitive, and rapid technique for detection of genomic DNA. The end-product of the technique is a white precipitate of magnesium pyrophosphate that is visible without the use of gel electrophoresis. The LAMP method was applied to the detection of canine parvovirus (CPV) genomic DNA. A set of 4 primers, 2 outer and 2 inner, were designed from CPV genomic DNA targeting the VP2 gene. The optimal reaction time and temperature for LAMP were determined to be 60 minutes and 63 degrees C. On the basis of results for 50 canine fecal samples using polymerase chain reaction (PCR) analysis as the gold standard, the relative sensitivity of LAMP was 100% and the relative specificity was 76.9%. The detection limit of the LAMP method was 10(-1) median tissue culture infective doses (TCID50)/ml, compared with 10 TCID50/ml for PCR analysis. In addition to the advantage resulting from visual detection of the end product, the LAMP method is very rapid, requiring only 1 hour to complete. This assay would be a viable alterative to PCR analysis for diagnosis of CPV infection in dogs. The LAMP method holds promise for use as a diagnostic assay for CPV detection in a clinical setting.     

南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西南宁地区犬细小病毒（CPV）的流行现状与病毒变异情况,本试验对初步确诊为犬细小病毒病的12份阳性病料提取基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因序列并测序,将12个阳性毒株样本VP2基因测序结果与GenBank中登录的17株国内外CPV分离株VP2基因进行同源性比对,采用Mega 7.0软件绘制遗传进化树,分析其病毒亚型和遗传进化情况。结果显示,成功扩增得到12个毒株样本的VP2基因片段,大小约1 755 bp,12株阳性样本毒株的VP2基因同源性在99.2%~100.0%之间,其中NN01与NN07、NN02与NN06同源性最高,为100.0%;阳性样本毒株与国内其他分离株VP2基因的同源性为97.6%~100.0%,其中NN08、NN10及NN04与CPV-ZJ1579同源性最高,均为100.0%,属于CPV-2a亚型;阳性样本毒株与国外代表性毒株同源性在98.1%~99.8%之间。遗传进化树分析表明,12个样本毒株中有3株属于CPV-2a亚型,3株属于CPV-2b亚型,6株属于CPV-2c亚型。这是继2018年初广西分离到CPV-2c型CPV后,首次发现南宁地区大规模流行CPV-2c亚型病毒,预示着CPV-2c亚型CPV在国内的流行正在增加。综上所述,广西南宁地区CPV-2a、CPV-2b与CPV-2c亚型并存,但CPV-2c亚型的比重比其他地区大,这也给该地区提供了新的防治信息,在实际CPV防控工作中除了对CPV-2a、CPV-2b等传统流行亚型的关注之外,更应该重视CPV-2c亚型CPV的防控。     

犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了研究当前犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）国内流行株的遗传变异情况,试验从北京某宠物基地采集疑似CPV感染死亡犬的肠道组织,无菌处理病料后,用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学和攻毒试验进行鉴定。结果表明,病毒在F81细胞上出现明显的细胞病变（CPE）,电镜观察可见直径20 nm左右的病毒粒子,血凝效价1：256,PCR鉴定在570 bp处有特异性条带,证明分离出1株CPV,命名为CPV-BJ03/17。全基因组测序分析表明,病毒基因组全长4 620 bp,提交GenBank,登录号为：MF134808;该毒株与广东（SC02/2011）、深圳（CPV-s5）和甘肃（CPV-LZ1）等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.7%。VP2氨基酸序列分析表明,CPV-BJ03/17分离株确定为New CPV-2a亚型,主要氨基酸位点与近期分离株BJ15-1等相比无明显变化。动物回归试验表明,CPV-BJ03/17为CPV强毒株。本研究分离出1株CPV强毒株,通过比较CPV的流行情况和遗传变异规律,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。     

Sequence Analysis of Canine Parvovirus VP2 Gene in Guangzhou

Canine parvovirus disease was a highly contagious disease and the clinical symptoms were characterized by acute hemorrhagic enteritis and myocarditis. To estimate the prevalence of the disease around Guangzhou, canine parvovirus (CPV) was isolated from suspected feces from 2011 to 2012. Amplification and sequence analysis of VP2 gene showed the antigenic type of 8 CPV strains except SCAU-5 (CPV-2b) belonged to CPV-2a,which indicated that CPV-2a was the predominate type around Guangzhou area from 2011 to 2012.