PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

建立了一种检测猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验法（IPMA），并组装成PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒。对该试剂盒的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验，并与国外IDEXX ELISA试剂盒进行了比较。结果显示，用该试剂盒检测PRRSV人工接种猪血清样品，第1周抗体阳性检出率为50％，从第2周起抗体阳性检出率均为100％，而对照组猪血清抗体检测均为阴性。该试剂盒重复性好，-20℃保存18个月稳定，与其他病毒参考血清无交叉反应，与国外IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83．3%。用该试剂盒对采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、上海等地13个猪场的520份正常猪血清样品进行了抗体检测，结果，4个猪场阳性率高达90％以上，仅有2个猪场为阴性，其余猪场阳性率为10％～57%。     

PRRSV野毒感染猪群免疫接种弱毒活疫苗的效果分析

为评估猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)弱毒活疫苗的免疫效果,本研究在两个小型猪场各选取两窝仔猪,在免疫接种猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)弱毒活疫苗后不同时间采集血清,应用RT-PCR检测PRRSV核酸,应用N-ELISA和G-ELISA两种试剂盒检测PRRSV抗体。结果发现,免疫前0d可以从仔猪血清中检测到PRRSV野毒株核酸,可持续到免疫后30d;相对应的母猪在免疫前0d可从血清中检测到PRRSV野毒株核酸。试验仔猪在免疫前0d未能检测到PRRSV抗体,但在免疫后30~150d均可检测到PRRSV抗体,其中N-ELISA试剂盒的阳性检出率在免疫后30、60d高于G-ELISA试剂盒的阳性检出率,而在免疫后120、150d则低于G-ELISA试剂盒的阳性检出率。使用两种ELISA试剂盒共同检测216份血清样品,检测结果的总体符合率为95.83%;配对χ2检验,P0.05,两者差异不显著;Kappa值为0.87,属于极强一致性;两者相关系数r为0.605,具有显著线性相关。表明免疫接种弱毒活疫苗可以有效清除野毒感染猪群中的野毒株,N-ELISA和G-ELISA两种ELISA试剂盒均可用于评估弱毒活疫苗的免疫效果。     

四种试剂盒检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗体的对比试验

使用国产的4种猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体ELISA诊断试剂盒(VP1-ELISA)、猪口蹄疫O型液相阻断ELISA检测试剂盒(LB-ELISA)、猪口蹄疫正向间接血凝试剂盒、猪O型口蹄疫病毒ELISA抗体检测试剂盒(O-ELISA)同时检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后的50份血清样品,阳性率分别为98.0%、94.0%、54.0%、90.0%。同时使用农业部规定的3种试剂盒分别检测20份血清样品的抗体滴度发现,VP1-ELISA试剂盒和LB-ELISA试剂盒阳性符合率为95%,平均抗体滴度相差0.7,与IHA试剂盒符合率为55%,平均抗体滴度相差3.8,故LB-ELISA试剂盒可以用来评价合成肽疫苗免疫的抗体,而IHA试剂盒不能用来检测合成肽疫苗免疫的抗体。     

以PRRSV Nsp2-399重组蛋白为包被抗原建立PRRSV抗体ELISA检测方法

为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2-399重组蛋白,以及利用Nsp2-399蛋白建立PRRSV早期感染的ELISA检测方法,试验克隆、原核表达了PRRSV DY株(GenBank登录号为JN864948)Nsp2-399重组蛋白,同时利用该蛋白建立并优化了ELISA检测方法。结果表明:成功克隆表达了PRRSV Nsp2-399重组蛋白,并建立、优化了Nsp2-399 ELISA检测方法。优化后的Nsp2-399 ELISA的最佳抗原包被浓度为1μg/mL,血清最佳稀释度为1∶40,最佳封闭液为10%胎牛血清,酶标二抗的最佳工作稀释度为1∶4 000,最佳显色条件为37℃、15 min。猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒阳性血清样品用建立的Nsp2-399 ELISA方法进行检测,S/P值均小于0.21,ELISA方法特异性良好。用本试验建立的ELISA方法和IDEXX ELISA检测试剂盒分别检测血清样品125份,总符合率为94.40%。说明成功建立了Nsp2-399 ELISA抗体检测方法,可用于PRRSV的抗体检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30min,显色时间为10min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。     

传染性支气管炎病毒(M41株)HI试验抗原的特异性和敏感性试验

采用本研究室制备的3批传染性支气管炎病毒(IBV,M41株)HI试验抗原,分别对100份和80份不同鸡血清进行IBV HI抗体检测,同时用IBV ELISA抗体检测试剂盒进行检测,比较两种不同方法检测的特异性和敏感性。结果显示,特异性试验中80份SPF鸡血清,自制抗原检测均为阴性,IBV ELISA检测79份为阴性,10份其他鸡病血清,两种方法检测9份均为阴性,10份IBV阳性血清两种方法检测均为阳性;敏感性试验中,74份已知IB疫苗免疫或IBV M41株感染鸡血清IBV HI检测72份为阳性,阳性检出率为97.3%(72/74),IBV ELISA检测74份均为阳性,阳性检出率为100%(74/74),SPF鸡血清及其他鸡病血清,两种方法检测均为阴性,两种检测方法总符合率为97.5%,差异不显著(P0.05)。试验结果证明,本研究室自制抗原具有良好的特异性,特异性为100%,抗原同时具有良好的敏感性,但IBV ELISA方法的敏感性要高于IBV HI方法。     

PRRSV重组N蛋白表达、纯化及间接ELISA检测试剂盒的研制

采用RT-PCR扩增出大小409bp猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因（PRRSV N gene）,将该基因克隆到表达载体pGEX-KG,构建重组表达载体pGEX-KG-N,转化表达菌株BL21（DM3）诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组N蛋白获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为41 000,并具有良好的免疫学活性。扩大诱导培养,收集菌体,提取包涵体,用GST-Protein Purtification Kit亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳检测纯度达到90%以上,可满足诊断抗原质量要求。用纯化PRRSV重组核衣壳蛋白GST-N为包被抗原,建立检测PRRSV血清的间接ELISA诊断方法,并组装ELISA试剂盒。优化后抗原最适包被质量浓度为2.5mg/L;血清最适稀释度为1∶100;对血清样本检测临界值为0.224;与美国IDEXX公司的HerdChek ELISA试剂盒符合率为92%,特异性为95%,敏感性为90%;与猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒等常见猪繁殖障碍病标准阳性血清无交叉反应。ELISA试剂盒批内和批间变异系数分别为3.44%～6.34%和5.04%～7.64%。置4℃条件保存12个月,试剂盒稳定性无明显改变。该试剂盒对350份临床疑似血清检出率为88.6%。研制的ELISA试剂盒为PRRSV临床血清抗体检测及流行病学调查提供了技术手段。     

应用Kappa检验比较猪蓝耳病ELISA抗体检测试剂盒

[目的]比较两个猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体酶联免疫吸附试验（ ELISA）检测试剂盒结果的一致性。[方法]对390份猪血清进行PRRSV抗体ELISA检测,应用Kappa检验比较两种试剂盒检测结果的一致性并进行分析。[结果]两种试剂盒联合检测出250份PRRSV抗体阳性和70份阴性,阳性一致性为80.65%,阴性一致性为87.50%,符合率82.1%,结果一致性为中度一致（ Kappa值=0.552）。[结论]2种方法检测结果一致性较好,建议根据实际需要选择PRRSV抗体检测试剂盒。     

两种O型口蹄疫ELISA检测试剂盒的对比

为比较哪种ELISA试剂盒能够更准确、简便、快捷地检测出口蹄疫病毒抗体,本研究使用液相阻断酶联免疫吸附试验(LB-ELISA)试剂盒和固相竞争酶联免疫吸附试验(SPC-ELISA)试剂盒,对2014年广西各市县动物疫病预防控制中心送检的已免疫过口蹄疫疫苗的猪、牛、羊血清共计1121份进行了检测,对比两种试剂盒的特异性、敏感性、阳性检出率及符合率。检测结果表明,两种口蹄疫ELISA试剂盒的阳性检出率不同,LB-ELISA的阳性检出率比SPC-ELISA高2.4%;LB-ELISA试剂盒对血清抗体滴度水平的要求相比SPC-ELISA试剂盒要低,因此LB-ELISA试剂盒更适合于口蹄疫病毒感染的检测。     

检测PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法的建立

用大肠杆菌BL21（DE3）pLysS表达PRRSV重组N蛋白作为包被抗原,建立检测猪群PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法,并对临床上采集的256份猪血清样本进行检测,结果66份呈阳性,用IDEXXPRRSV抗体检测试剂盒检测,检出的阳性血清为63份,两者的符合率为98.8%。Western blot检测结果58份阳性,两者的符合率为96.9%。试验结果表明,本试验所建立的间接阻断ELISA方法具有良好敏感性和特异性,可用于PRRS流行病学调查和疾病的诊断。