猪圆环病毒血清I型和II型的PCR鉴别

根据基因库中猪圆环病毒 (PCV)的基因序列 ,设计并合成了 3条引物 ,建立复合PCR,对 2株 PK-1 5细胞及一些疑似 PCV感染的病料进行了 PCV检测。结果 2株 PK-1 5细胞和所有病料都可扩增出 PCV-1的基因片段 ,其中 1株 PK-1 5细胞和一些病料还扩增得到了PCV-2的 DNA片段。证明应用设计的引物进行复合 PCR快速检测 PCV可行 ,为 PCV的检测分型及 PCV相关疾病的诊断奠定了基础     

猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性

为研究猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性，通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段，与真核表达栽体pCI—neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h，通过RT-PCR可检测到PCV2 Rep mRNA的转录；用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验，可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中，PCV2 Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆，在表达量高的细胞中，细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白，表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。     

应用PCR-RFLP方法对四川猪圆环病毒的检测与分型研究

根据GenBank中猪圆环病毒(PCV)的基因序列,设计并合成了1条引物,建立聚合酶链反应限制性酶切片段长度多态性分析(PCR RFLP)方法,对PK-15细胞、IBRS 2细胞以及疑似猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)的病料进行了PCV检测,以及血清型的鉴定。结果表明:IBRS 2细胞和1个PMWS病料检测出PCV 1的基因片段,1个PMWS病料和1个PDNS病料检测出PCV 2基因片段。证明应用PCR RFLP快速检测PCV是可行的,为PCV的检测、分型以及PCV相关疾病的诊断奠定了基础。     

猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立

根据GenBank中20株猪圆环病毒（PCV2）核苷酸序列设计两对引物，建立的检测猪圆环病毒的多重PCR方法，其中引物P1、P2为PCV特异性，扩增938bp片段。P3、P4为PCV2特异性扩增490bp，因此本方法不仅可以扩增PCV片段，还可以同时区分PCV1和PCV2。该方法具有良好的特异性和敏感性，为猪圆环病毒的临床诊断与流行病学调查等研究奠定了基础。     

PCV2感染性克隆的构建与拯救病毒在不同细胞系中的增殖特性

将猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染性克隆分别转染到猪肾上皮细胞(PK15)和猪小肠上皮细胞(J2)中获得拯救病毒PCV2,比较病毒在2个细胞系中的复制动力学差异。设计特异性引物,通过PCR法和Over-lap PCR技术获得含1.1个拷贝PCV2基因组的DNA片段,克隆于p SP72载体获得PCV2感染性克隆。用PCV2感染性克隆分别转染PK15和J2细胞,Real-time PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测结果表明:拯救病毒可在PK15和J2细胞系中分别连续盲传10代以上,且PK15培养的PCV2基因组的拷贝数极显著高于J2培养的(P0.01),提示获得的PCV2拯救病毒在PK15的增殖性能优于J2,为进一步探索PCV2基因组的功能及PCV2相关发病机制奠定了基础。     

适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建

<正>为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第     

江苏部分地区猪圆环病毒2型的分子流行病学检测

根据猪圆环病毒2型（PCV2）基因序列,设计1对特异性PCV2的鉴定引物,利用PCR方法对65份疑似PCV2感染的病料进行检测。PCR检测为阳性的病料经处理后,接种无PCV污染的Dulac细胞进行间接免疫荧光检测。对各分离毒株的全基因组进行PCR扩增、测序和基因型分析。结果表明：共分离鉴定21株PCV2,均属2b基因型,其中有16株为1C群,5株为1A/1B群。研究显示PCV2b 1C群已在江苏成为流行毒株。     

PK15细胞α干扰素效应因子qPCR检测方法的建立及其初步应用

 
为建立一种用SYBR Green I荧光染料检测PK 15细胞α干扰素(α IFN)效应因子Mx1、OAS的mRNA表达水平的qPCR检测方法，通过在猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2, PCV2）抑制α IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。根据GenBank中目的基因的序列，利用分子生物学软件Premier 5.0在其保守区设计并合成相应的特异性引物。利用TRIzol法提取总RNA，经Oligo d(T)15进行反转录，利用PCR扩增各段目的基因，并克隆至pMD 18 T载体，转化大肠杆菌DH 5α，经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR Green I qPCR标准曲线和溶解曲线，并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时qPCR方法，检测PCV2对α IFN效应因子的抑制效果。对建立的PK 15细胞α IFN效应因子SYBR Green I qPCR方法进行分析，结果表明Mx1、OAS和内参β actin基因的Ct值与标准品稀释度在1×101～1×108 copies/μL的范围分别呈良好的线性关系。PK 15细胞在接种PCV2，并受到α IFN刺激后Mx1、OAS的相对表达量较未接种PCV2明显降低。本试验建立了PK 15细胞α IFN效应因子的qPCR检测方法，为在mRNA水平上对PK 15细胞α IFN效应因子的定量分析奠定了基础，并成功地初步应用于PCV2抑制α IFN发挥效应的信号通路研究中。     

猪圆环病毒2型Rep蛋白在真核细胞中的表达与定位

为了构建Rep蛋白真核表达质粒，研究PCV2复制过程中的亚细胞分布。本研究借助PCR方法扩增PCV2的Rep基因，并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C3中，并转染PK15细胞和Vero细胞。结果显示，重组的pEGFP—PCV2-Rep融合蛋白能够在PK15细胞和Vero细胞中表达。结论认为pEGFP—PCV2-Rep质粒转染PK15细胞和Vero细胞后48h，PCV2的Rep蛋白主要定位在PK15细胞和Vero细胞的细胞核。     

猪圆环病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、测序及其在原核细胞中的表达

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列，设计合成1对特异性引物，用PCR方法从接种PCV2吉林株（JL01）PK-15细胞中，扩增出PCV2毒株的ORF2基因。将扩增片段克隆于pMD18-T载体，进行序列测定。结果表明，PCV2JL01毒株的ORF2基因核苷酸长度为702bp。将重组质粒用Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后与同样处理的pET-32a载体连接，转化BL21细胞后，挑取阳性克隆。经PCR和酶切鉴定后，用IPTG诱导，细菌裂解液经SDS—PAGE和Western—blot分析，表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达，并能被PCV2阳性血清所识别。