首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到17条相似文献,搜索用时 156 毫秒
1.
甲醇酵母 Pichia pastoris表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统,在其乙醇氧化酶 AOX1基因启动子的控制下,某些外源基因(如 TNF、EGF等)的表达量可达克每升以上。虽然该系统是一种优良的表达系统,但有许多因素影响外源基因在其中的表达,包括外源基因的拷贝数及整合到酵母染色体的位置和方式、mRNA的5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始密码子的上下文、外源基因A+T的组成与转录和翻译的阻断、密码子的偏爱性、信号肽的特性、产物的稳定性、宿主菌的生理特性、培养基成分和培养条件等。在应用该表达系统过程中,这些因素都需加以考虑。本文将就这些因素作一概述和讨论,以有利于提高外原基因在该系统中的表达水平。  相似文献   

2.
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因在比赤酵母中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
根据酵母表达系统的密码子偏爱性、poly(A)信号以及外源基因mRNA5′端的二级结构等特性,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF6基因进行简并改造和人工合成,然后以正确的读码框架插和到分泌型母高效表达载体pPICZαA的α因子信号肽编码序列3′端,构建成酵母转移载体,用化学方法转化酵母菌GS115,和酶切鉴定证实,目的基因已整合到重组酵母菌染色体中。对重组酵母进行诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western blot分析筛选,获得了一株高效表达目的蛋白的重组酵母菌,该重蛋白有免疫学活性,其表达水平可达2.0g/L,而未经改造的ORF6基因则不表达。  相似文献   

3.
为了揭示猪α-(1,2)岩藻糖转移酶2(FUT2)基因密码子使用特性并提高其在外源宿主内的表达量,本研究综合运用EMBOSS Explorer网站和CodonW软件包分析了猪FUT2基因的密码子使用偏好性的相关参数,并与3种模式生物(大肠杆菌、酵母菌和果蝇)基因组密码子使用模式进行比较,最后参照与之最为相近的模式生物基因组密码子使用方式,利用JCat和OPTIMIZER两个密码子优化网站对猪FUT2基因密码子进行优化。结果显示,猪FUT2基因表达水平不高,存在24种偏好密码子,且这24种偏好密码子中有23种以G/C结尾;猪FUT2基因与果蝇基因组密码子使用模式的差异小于大肠杆菌和酵母基因组,表明果蝇更适合猪FUT2基因的外源表达;根据果蝇基因组密码子使用模式优化猪FUT2基因密码子,优化后其适应指数有了明显提高,而整体GC含量没有明显变化,说明在理论上猪FUT2基因优化成功。本研究从翻译水平上揭示了猪FUT2基因的密码子使用特性,为其在遗传改良中选择最佳外源表达系统及提高其在宿主细胞内的表达水平提供一定的理论依据。  相似文献   

4.
为了揭示猪α-(1,2)岩藻糖转移酶2(FUT2)基因密码子使用特性并提高其在外源宿主内的表达量,本研究综合运用EMBOSS Explorer网站和CodonW软件包分析了猪FUT2基因的密码子使用偏好性的相关参数,并与3种模式生物(大肠杆菌、酵母菌和果蝇)基因组密码子使用模式进行比较,最后参照与之最为相近的模式生物基因组密码子使用方式,利用JCat和OPTIMIZER两个密码子优化网站对猪FUT2基因密码子进行优化。结果显示,猪FUT2基因表达水平不高,存在24种偏好密码子,且这24种偏好密码子中有23种以G/C结尾;猪FUT2基因与果蝇基因组密码子使用模式的差异小于大肠杆菌和酵母基因组,表明果蝇更适合猪FUT2基因的外源表达;根据果蝇基因组密码子使用模式优化猪FUT2基因密码子,优化后其适应指数有了明显提高,而整体GC含量没有明显变化,说明在理论上猪FUT2基因优化成功。本研究从翻译水平上揭示了猪FUT2基因的密码子使用特性,为其在遗传改良中选择最佳外源表达系统及提高其在宿主细胞内的表达水平提供一定的理论依据。  相似文献   

5.
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因在毕赤酵母中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
根据酵母表达系统的密码子偏爱性、poly(A)信号以及外源基因mRNA5’端的二级结构等特性 ,对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)ORF6基因进行简并改造和人工合成 ,然后以正确的读码框架插入到分泌型酵母高效表达载体pPICZαA的α因子信号肽编码序列 3’端 ,构建成酵母转移载体 ,用化学方法转化受体酵母菌GS115 ,经PCR和酶切鉴定证实 ,目的基因已整合到重组酵母菌染色体中。对重组酵母进行诱导表达 ,并通过SDS_PAGE和Westernblot分析进行筛选 ,获得了一株高效表达目的蛋白的重组酵母菌 ,该重组蛋白具有免疫学活性 ,其表达水平可达 2 .0g/L ,而未经改造的ORF6基因则不表达  相似文献   

6.
大肠杆菌表达系统的影响因素   总被引:4,自引:0,他引:4  
大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但并非每一种基因都能在其中有效表达。基因的表达受到多种因素的影响,表达效率也有很大差异。本文从外源基因本身特性和表达系统的特性及其他因素等方面阐明外源基因高效表达的影响因素,从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。  相似文献   

7.
1)外源蛋白在酵母中表达受mRNA5′端和3′端的UTR序列的核苷酸序列及长度的干扰比较大。为保证外源蛋白的成功表达,目的基因5′端UTR应该与AOX1基因的mRNA5′端UTR尽量相似或保持一致。5′端UTR过长或过短都不利于外源蛋白的表达,因为过长或过短会影响核糖体40S亚单位的识别,只有在合适长度的5′端UTR的情况下才能保(上接第11期75页)  相似文献   

8.
生长分化因子9(GDF9)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一个新成员,对哺乳动物卵泡的发育有重要的调控作用。本研究克隆了牛GDF9基因5′侧翼区1 370 bp的基因组序列,生物信息学分析表明,该区域的平均GC含量为38.5%,利用CpG岛在线预测软件CpGProD分析表明,牛GDF9基因5′侧翼区没有CpG岛;利用Promoter在线工具分析发现牛GDF9基因可能存在2个启动子位点,一个在翻译起始密码子前353bp处,另一个在翻译起始密码子前683 bp处;利用TFSiteScan在线程序分析发现该区域有98个潜在的转录因子结合位点,其中包括一些真核生物启动子的核心元件,如1个TATA-box、4个GC-box等,表明该区域是转录因子结合位点比较密集的区域。  相似文献   

9.
碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类蛋白。目前在许多植物中已发现大量的bZIP转录因子,这些bZIP转录因子成员广泛参与种子贮藏基因的表达、植物的生长发育、光信号传导、病害防御、生物和非生物胁迫应答以及ABA的敏感性等各种信号的反应。本研究首次从紫花苜蓿(Medicago sativa)全转录组水平鉴定出bZIP转录因子家族共包含138个基因,根据bZIP蛋白序列进行系统进化分析可以将其分为10类;对MsbZIP基因的系统进化分析表明该基因家族在分类上有很高的保守性。该转录因子家族的基因密码子偏好性分析表明,MsbZIP基因密码子偏好使用A/T碱基。此外,MsbZIP基因GO功能注释分析结果显示,138个MsbZIP基因最终分为23个GO分类,总体包括分子功能和生物学过程两类。相关性分析结果表明,共有372对基因表达相关性极显著(P0.01)。本研究可为紫花苜蓿bZIP转录因子功能特性、进化历程和生物功能的深入研究奠定基础。  相似文献   

10.
为给猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)主要非结构蛋白(NS1)基因选择良好的宿主表达系统提供参考依据,本研究运用EMBOSS在线分析软件的CHIPS和CUSP程序对PPVNS1基因进行密码子偏爱性分析。结果显示PPVNS1基因的CAI值为0.642,ENC值为39.703,这表明NS1在密码子使用上存在较明显的偏爱性,且第三位核苷酸尤其偏爱A或T;从与PPVNS1基因密码子使用频率比值上看,使用频率差异较大的在大肠杆菌有33个、酵母有26个、人有27个;PPVNS1基因共有71个大肠杆菌稀有密码子,并且还有多个稀有密码子多次串联成簇出现的情况。结果表明酵母等真核生物与其密码子偏爱性较为接近,可作为该基因体外表达宿主的首选。  相似文献   

11.
在毕赤酵母真核表达系统中表达柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d(Emeria tenella eukaryotic initiation factor 3d,EteIF3d)基因,并获得具有天然构象的活性蛋白。将EteIF3d基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,将构建正确的重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞。在含1%甲醇的BMMY培养基中诱导培养,收集1~3 d的表达上清。表达产物进行SDS-PAGE检测,并用Western blot进行免疫学分析。结果表明,本研究成功构建了重组质粒pPIC9k-EteIF3d,并成功表达该蛋白,且该蛋白能与兔抗EteIF3d血清特异性结合,具有良好的抗原性。EteIF3d基因可在真核表达系统毕赤酵母中表达,且获得蛋白具有抗原性,从而为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。  相似文献   

12.
根据昆虫细胞密码子的偏嗜性,对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP2基因的密码子进行优化,利用Bac-to-Bac表达系统构建了表达优化VP2基因的重组杆状病毒,通过感染昆虫细胞(Sf9)获得病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。SDS-PAGE分析显示Sf9细胞中出现了65 kDa的蛋白条带,间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay,IFA)和Western blot结果均证实表达产物能与鼠抗GPV VP2抗体发生特异性反应,说明其具有良好的免疫反应性。同时,试验结果还证明,密码子优化后的GPV VP2基因在昆虫细胞中表达量得到了提高,明显高于野生型VP2基因。透射电镜观察纯化后的昆虫细胞表达产物,可见直径约30 nm的VLPs,表明密码子的优化并不影响VP2蛋白的组装。本研究为进一步研制诊断抗原以及新型GPV疫苗等奠定了基础。  相似文献   

13.
纤维素酶应用广泛,但因受到酶活低、成本高等诸多因素的制约,纤维素酶的工业化生产和应用受到限制.应用基因工程技术来获得高活性、高产量的纤维素酶资源越来越受到人们的重视.本文对纤维素酶分子结构、基因的克隆、原核与真核表达进展进行了综述,并提出构建纤维素酶酵母表达系统、木霉表达系统以及多个纤维素酶基因共表达系统是未来纤维素酶基因工程的发展趋势.  相似文献   

14.
为了研究miR-206的组织表达分布及其在鸡骨骼肌生长发育中的表达规律,预测其可能的作用机制,本研究采集4周龄金茅黑鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌、腿肌和腹脂8种组织及2、6、10、14、16周龄胸肌和腿肌组织,利用实时荧光定量PCR技术检测miR-206在8种组织及不同周龄胸肌和腿肌中的表达,利用生物信息学方法预测其靶基因并进行功能注释。结果显示,miR-206在公、母鸡胸肌和腿肌中表达量均极显著高于其他组织(P < 0.01),在腹脂、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中低表达,为鸡骨骼肌特异性表达miRNA;miR-206均在公、母鸡腿肌和胸肌组织生长早期(2周龄)表达最高,之后表达量逐渐下降。靶基因预测和功能分析发现,miR-206共有356个靶基因,其中21个与肌肉生成相关,多个靶基因已知参与调控肌肉生成,包括配对框7(paired box 7,Pax7)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)、脑衍生神经营养因子1(brain-derived neurotrophic factor 1,BDNF1)、视黄酸受体(retinoic acid receptor beta,RARB)和卷曲类受体7(frizzled class receptor 7,FZD7)基因。此外,发现miR-206靶基因富集到多条已知参与调控骨骼肌生成的信号通路,包括MAPK、Wnt、肌动蛋白骨架调控和黏着斑激酶信号通路。结合表达数据推测,miR-206可能通过靶向调控Pax7、IGF1、BDNF1、RARBFZD7基因和MAPK、Wnt等信号通路参与调控鸡肌肉生成。本研究揭示了金茅黑鸡miR-206的组织表达分布及其在鸡骨骼肌生长过程中的表达规律,并预测了其调控骨骼肌生成的可能作用机理,为进一步研究miR-206在鸡肌肉生长发育中的作用机理和表达调控奠定了基础。  相似文献   

15.
根据对载有ApNPV核多角体蛋白基因的片段的酶谱和核苷酸序列分析结果,采用人工合成寡核苷酸引物引导的点突变方法,去掉了该基因的起始密码子(ATG突变为ATT),经系列克隆组建了pApM740转移载体,其外源基因插入位点为nt+141(BamHI)。系用多聚酶链反应(Polymerase Chain Rea-ction简称PCR)技术,分别将nt+2~+140,nt+9~+140、和nt+37~+140切掉,组建了pApM740、741、748和736转移载体,其外源基因克隆位点分别为nt+1、+8和+36(均为BamHI切点)。将IL-4、DE基因分别克隆到pApM740、741、748和736载体中,并进行了转染表达实验:(1)将载有DE基因的上述四种载体质粒DNA分别与AcNPV_(WT)DNA共转染Sf9细胞、经免疫抗体荧光检测,供试4个载体所载DE基因均得到表达;(2)将pApM741-IL_4和pApM748-IL_4重组载体质粒DNA分别与ApNPV_(WT)DNA共转染柞蚕卵巢原代细胞,待多角体出现后,用PCR法检测病毒基因,证实IL-4基因已整合到ApNPV DNA基因组中;(3)将pApM748-DE重组载体质粒DNA与ApNPV _(WT)DNA共转染柞蚕蛹获得成功。对病蛹病毒DNA进行PCR检测,证实DE基因已整合到病毒基因组中;取病蛹体液,用免疫沉淀及Western blotting方法检测DE蛋白,证实DE蛋白确已被表达。从而初步建立了柞蚕NPV载体—昆虫细胞宿主和柞蚕NPV载体—柞蚕蛹活  相似文献   

16.
The objective of this study was to determine the influence of age on expression of insulin-like growth factor 1 (IGF1), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP5), myostatin (MSTN), and myosin (MYH1) genes which are related to growth and muscle development in the American Quarter Horse. Thus, horses (n = 10) from weanling, yearling, 2-, 3-, and 10-year-old age classes were sampled and gene expression was assessed by RT-qPCR. ΔCT was calculated using the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene as an internal normalizer. The generalized linear model was used to determine differentially expressed genes, by pairwise comparison between ages. Among technical replicates, the coefficient of variation ranged from 1.0 to 5.2% and was lower than the variation observed between biological replicates (2.1–12.9%). IGF1 demonstrated significantly lower expression in the 3-year-old age class than in weanlings and yearlings, but the 10-year-old age class displayed a significantly higher level than 2- and 3-year-old age classes. Expression of IGFBP5 was highest in weanlings compared with all other age classes. Expression of MSTN was significantly higher in weanlings than in other age classes, whereas 10-year-old horses had an intermediate level of expression, but significantly different from yearlings, 2- and 3-year-old fillies. Finally, expression of MYH1 was lower in 2- and 10-year-old horses than in weanlings and yearlings, whereas 3-year-old fillies demonstrated an intermediate level of expression. Differential expression patterns observed in this preliminary study provide insight into the physiological changes occurring throughout the life span of horses. These patterns could also help explain the variation in performance and endurance between individuals at different developmental stages.  相似文献   

17.
为进一步探索波形蛋白(vimentin)调控绒山羊绒毛生长的作用机制,以内蒙古遗传种子资源阿尔巴斯白绒山羊皮肤中的毛囊组织为材料,利用PCR技术和酵母双杂交技术对根据GenBank中山羊的vimentin蛋白序列,运用蛋白质互作在线软件预测和液相色谱质谱联用采集免疫共沉淀数据筛选出肌动蛋白(ACTB)和vimentin进行基因引物设计、克隆、酵母表达载体构建和蛋白互作鉴定。结果显示:成功克隆出绒山羊vimentin基因CDS区序列的长度为1 401 bp, ACTB基因CDS区序列的长度为1 128 bp;构建了酵母表达载体;试验组共转化pGBKT7-vimentin与pGADT7-ACTB的Y2HGold菌株在二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基和四缺板SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-GaL/AbA培养基上,均能生长出淡蓝色菌落,而在对照组共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基上长出白色菌落,表明共转化的pGBKT7-vimentin与pGADT-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac被激活,共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac未被激活。提示:vimentin与ACTB两种蛋白间存在相互作用。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号