基因芯片方法检测6种动物源性人兽共患病病原

为了建立可同时检测H5亚型禽流感病毒、狂犬病病毒、猪链球菌2型、炭疽芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的基因芯片检测方法,本实验根据GenBank中上述6种病原的基因序列,设计并合成了特异性的引物和探针.采用点样法制备杂交芯片,将上述病原扩增产物混合后与芯片杂交.杂交结果显示,针对本试验中6种人兽共患传染病所设计的寡核苷酸探针可特异性识别靶基因,与其他常见病原体之间没有交叉反应.检测的灵敏度在1.38×10-5pg/μL～151 pg/μL之间.将建立的基因芯片检测方法对临床样品进行检测,结果与荧光PCR方法一致.     

广东地区鸭-鱼混养场鸭粪中耐药基因的污染现状

采用荧光定量的方法对广东地区典型的鸭-鱼混养场中鸭粪中磺胺类、四环素类、β-内酰胺类和酰胺醇类的耐药基因丰度进行调查。结果显示:耐药基因的平均相对丰度为∑bla>∑tet>∑sul>∑cml;这17个耐药基因在所有的样品中均被检测到,其中sul1、sul2、tetO、tetA、tetB、blaTEM和fexB的平均相对丰度高分别达到了2.1×10-1copies/16SrDNA copies、3.82×10-1copies/16SrDNA copies、3.30×10-1 copies/16SrDNA copies、1.77×10-1 copies/16SrDNA copies、1.31×10-1 copies/16SrDNA copies、7.81×10-1 copies/16SrDNA copies和1.57×10-1 copies/16SrDNA copies,其中blaTEM的相对丰度最高。结果表明:鸭粪便中耐药基因的污染严重,其中β-内酰胺类药物耐药基因的丰度最高,酰胺醇类药物最低;在广东地区鸭粪中具有代表性的主要耐药基因,磺胺类是sul1和sul2;四环素类是tetO、tetA和tetB;β-内酰胺类是blaTEM;酰胺醇类是fexB、cmlA、fexA和floR。     

猪细小病毒检测基因芯片的构建及初步应用

本研究以猪细小病毒VP2基因为目的基因设计引物和探针,通过不对称PCR扩增Cy3标记的DNA片段与固定于芯片上的探针进行杂交,对杂交芯片进行扫描分析,根据荧光信号的强度来确定是否存在猪细小病毒。结果表明,采用浓度为5μmol/L的探针与PCR产物于47℃杂交1 h即可得到清晰的荧光信号,检测灵敏度可达34.5 ng/μL,同时用制备的基因芯片对临床20份疑似猪细小病毒病感染的病料进行检测,检测结果与PCR检测结果符合率达100%,表明基因芯片检侧技术是一种灵敏度高、特异好的检侧方法。该方法的建立可以快速有效地对猪细小病毒做出诊断,具有较好的应用前景。     

猪源大肠杆菌floR、CTX-M、mcr-1耐药基因多重PCR检测方法的建立

为了建立猪源大肠杆菌对氟苯尼考、β-内酰胺类与粘杆菌素耐药基因的多重PCR检测方法,本研究以氟苯尼考耐药基因floR、β-内酰胺耐药基因CTX-M、粘杆菌素耐药基因mcr-1作为目的基因,设计3对特异性引物,通过对多重PCR反应体系及条件的优化,成功建立了多重PCR检测方法。该方法的灵敏度为1.46×10^5CFU/m L,具有高度特异性、敏感性和可重复性。本方法的建立为大肠杆菌中常见耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段。     

一株猪丹毒杆菌分离株的致病性与耐药性分析

从某猪场病死猪心血、肝、脾等组织分离到1株革兰阳性杆菌,经细菌形态、16S rRNA基因扩增,确定分离菌为猪丹毒杆菌。对分离菌进一步开展了药物敏感性试验、耐药基因的检测、细菌致病性试验及免疫保护性试验。结果发现:分离株对β-内酰胺类、大环内酯类、氟苯尼考高敏,但对氨基糖苷类、四环素、林可霉素、诺氟沙星等耐药;分离株可扩增出氨基糖苷类耐药基因aac C2和四环素耐药基因tetB,但菌株中没有扩增到四环素耐药基因tetA。细菌致病性试验表明该毒株对小鼠的LD50为1.77×10~5cfu/mL。小鼠免疫保护试验结果表明,疫苗G4T10免疫后28 d,以分离株攻毒,对照组全部死亡(5/5),免疫组小鼠攻毒后没有死亡,仅表现为体重减轻,表明现用猪丹毒疫苗能保护小鼠抵抗猪丹毒的致死性攻击。     

红霉素与四环素耐药基因在猪链球菌临床分离株中的检测

为了解临床分离的48株猪链球菌对大环内酯类药物及四环素耐药基因的分布,用微量稀释法测定48株临床分离的猪链球菌对大环内酯类、四环素、β-内酰胺类及头孢类9种抗生素的药物敏感性,建立PCR方法对耐药菌株大环内酯类耐药基因ermA/B/C、mefA/E、msrD、mphB、23S rRNA,L4,L22和四环素耐药基因tetM、tetO、tetL、tetK及与Tn916转座子相关的int和xis基因进行检测。结果表明,31株2型猪链球菌中大环内酯类药物耐药率为3.23%,17株9型猪链球菌红霉素耐药率为88.24%,泰乐菌素、磷酸替米考星、阿奇霉素的耐药率均为70.59%。48株猪链球菌对四环素均耐药,但对青霉素、阿莫西林、头孢曲松钠、氨苄西林均敏感。大环内酯类耐药基因主要以ermB为主,占75%(12/16),mefA/E、msrD占25%(4/16),16株红霉素耐药菌株中,tetM、tetO、int、xis的检出率分别为25%(4/16)、62.5%(10/16)、31.25%(5/16)和31.25%(5/16),没有检测到ermA、ermC、mphB、tetL、tetK。所有红霉素耐药菌株均未检测到23S rRNA、L4和L22突变。     

肉鸡屠宰加工生产链中沙门菌耐药基因检测与耐药性分析

利用聚合酶链式反应(PCR)扩增整合酶基因intⅠ检测沙门菌中Ⅰ类整合子携带率及可变区耐药基因盒并从β-内酰胺类、磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类和酰胺醇类等5类抗生素的15种耐药基因进行检测,微量肉汤稀释法(MIC法)测定菌株对8类13种抗菌药的敏感程度。结果显示:肉鸡屠宰加工生产链中分离的沙门菌共检测12种耐药基因,未检测到β-内酰胺类的blaoxA-1group、blapse-1、四环素类的tetB和tet X基因。其中,以耐药基因catⅠ的检出率最高,87%(59/68);其次是tet G,检测率是85%(58/68);blatem耐药基因69%(47/68)。69%(47/68)的沙门菌检测出第Ⅰ类整合子。PCR扩增Ⅰ类整合子耐药基因盒,检测率为73%(35/47),扩增产物大小为1 009,1 664bp,携带aadA5、dfrl7和aadA2耐药基因,可分别介导对氨基糖苷类抗生素壮观霉素、链霉素和磺胺类药物甲氧苄氨嘧啶的耐药。68株菌中对AM的耐药率最高,多重耐药(≥2)菌株高达85%。结果表明:肉鸡屠宰加工生产链中沙门菌检测到较高的耐药基因及整合子携带率,对常见抗生素具有不同程度的耐药性,且耐药基因在耐药药敏试验结果与耐药基因的检测结果具有一致性。     

应用液态悬浮芯片技术建立17种大肠杆菌耐药基因多重快速检测方法

为建立一种快速、高通量的多重耐药基因检测方法,利用Luminex液态芯片平台,建立了可同时检测17种耐药基因的液态芯片检测方法。该方法对大肠杆菌常见的七大类抗菌药物所对应的17种耐药基因（blaSHV、blaCMY-1、Aph3-IIa-1、aac(6)-Ib-cr、aadA-1、cmlA-1、gyrA、mcr-1、NDM-1、parC、qnrS-1、sul-1、sul-2、sul-3、tetA、tetB、tetX）进行序列分析,随后依次对其设计多重PCR特异性引物,构建特异的阳性质粒作为阳性参比品进行液态芯片检测条件优化,从而进行多重耐药基因液态芯片检测方法的研发。结果显示：成功构建了17种耐药基因的阳性质粒,并建立了两套体系用于检测17种耐药基因。在特异性试验中,两套体系中的检测信号无干扰,具有较高的特异性数值;敏感性试验中,体系一的单一质粒最低检测量为102~104 copies/μL,混合质粒为103~105 copies/μL;体系二的单一质粒最低检测量为102~105 copies/μL,混合质粒为104~106 copies/μL;有效性试验中,液态芯片法与PCR检测结果的Kappa值多在0.60以上,具有高度一致性。结果表明,本研究建立的2套液态芯片检测体系具有高通量、高灵敏和高特异性的优点,可同时对17种耐药基因进行检测,能够达到快速检测的目的。     

3种实验动物相关病原液相芯片检测方法的建立

为建立快速高通量检测实验动物质量相关布鲁菌、沙门菌、弓形虫3种病原体的方法,根据其序列设计引物及探针,探针经修饰后与荧光编码微球偶联,将偶联后的探针与PCR产物杂交反应,通过液相芯片检测仪(Luminex200)检测荧光信号,分析实验动物感染布鲁菌、沙门菌和弓形虫的情况。结果显示:初步建立了可同时检测布鲁菌、沙门菌和弓形虫的液相芯片检测方法,可特异地检测出3种目标病原的基因荧光信号,未检测出其他相关病原基因荧光信号;检测灵敏度达50拷贝/反应。本研究所建立的液相芯片检测方法可快速检测3种实验动物相关重要人兽共患病原体,对公共安全卫生保障、进出境实验动物检疫具有重要意义。     

革兰氏阳性菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制及基因同源性的分析

简述了几种常见革兰氏阳性菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制,利用DNAMAN软件分析革兰氏阳性菌间β-内酰胺类抗生素耐药基因的同源性,发现耐药基因在同属不同种的阳性菌间同源性高,但也有不同属间同源性高达95%的情况,为筛选细菌不同种属间具有代表性的耐药基因和后续研制耐药基因检测芯片奠定了基础.