新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析

本试验首先以ＮＤＶＦ４８Ｅ９株的基因组ＲＮＡ为模板,逆转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第一链,再通过ＰＣＲ技术扩增Ｆ基因的ｃＤＮＡ,然后将其克隆到质粒ｐＵＣ１９中,经分子量比较、酶切分析、ＰＣＲ等方法证明,我们已经获得了ＮＤＶＦ４８Ｅ９株Ｆ基因的阳性克隆。经初步序列分析,ＦＡ段核苷酸序列与参考株（Ｄ２６／７６）序列同源性为８９％,ＦＢ段同源性为９１％。二者的氨基酸序列表明,Ｆ４８Ｅ９株Ｆ蛋白裂解位点与其它强毒株裂解位点氨基酸组成相同,即１１２ＲＲＱＲＲ１１６Ｆ１１７。这两段序列中包含的三个Ｃｙｓ残基和三个潜在的糖基化位点都相当保守。     

新城疫病毒F48E9株HN基因的克隆与酶切分析

为深入探讨新城疫病毒（ＮＤＶ）的结构与功能的关系，扩增和克隆了Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ的ＨＮ基因。首先以提取的Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ基因组ＲＮＡ为模板逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，然后用ＨＮ基因特异性引物作ＰＣＲ扩增ＨＮｃＤＮＡ，结果得到１条分子量约１．８ｋｂ的ＤＮＡ带，与ＮＤＶＨＮ基因的大小一致。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交进一步证实其为ＨＮ特异性ｃＤＮＡ。随后采用平端连接法将其克隆到ｐＳＶ·Ｓｐｏｒｔｌ质粒中，应用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳｃａⅠ、ＭｌｕⅠ、ＡｐａⅠ、ＰｓｔⅠ、和ＳｍａⅠ对ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮｃＤＮＡ重组质粒作单酶或双酶切，结果表明，ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮ基因较ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１株的ＨＮ基因缺少１个ＭｌｕⅠ位点（７０５ｂｐ左右），多１个ＰｓｔⅠ位点（８０２ｂｐ左右）。     

鸡新城疫病毒B95株融合蛋白基因的克隆与序列分析

以鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）澳大利亚布里斯班分离株Ｒ９５的 ＲＮＡ为模板,运用的ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增其融合蛋白（Ｆ０）基因的ｃＤＮＡ。将扩增的Ｆ基因克隆到质粒ＰＵＣ１９中,转化入大肠杆菌ＪＭ１０９中,经ＡＩＸ平板筛选,ＰＣＲ等方法鉴定出Ｆ基因的阳性重组质粒,同时测定了Ｆ基因５’端７０９个核苷酸及３’端７６８个核苷酸的序列,对相应的氨基酸序列的研究表明,Ｂ９５株属弱毒株,含有Ｆ０中保守的疏水功能区和可糖基化位点,Ｂ９５与强毒株Ｆ４８Ｅ８株、Ｍｉｙａｄｅｒａ株和中等毒力的Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ Ｃ株的氨基酸序列的同源性在９０％左右。     

猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF7基因的克隆及鉴定

本研究利用对应于ＡＴＣＣＶＲ－２３３２及ＬＶＯＲＦ７基因保守序列的１对均为２８个碱基的引物１００１１ＰＣＳ、１０１０ＰＣＲ对ＰＲＲＳＶ中国分离株Ｂ１３进行ＲＴ－ＰＣＲ，结果扩增出了１条包括完整ＯＲＦ７基因的５１０ｂｐ的ＤＮＡ片段。纯化此扩增产物，并对其进行ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ双酶切，与用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ双酶切及碱性磷酸酶处理的ＰＵＣ１８载体连接。转化大肠杆菌。结果得到了１个Ｂ１３ＯＲＦ７基因与ＰＵＣ１８载体的重组质粒ＰＵＣ１８Ｂ１３ＯＲＦ７１０。通过ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ及ＰＣＲ证明此重组质粒即为Ｂ１３ＯＲＦ７基因与ＰＵＣ１８载体的重组质粒。从而为ＯＲＦ７基因及所表达的核衣壳蛋白进一步研究奠定了基础。     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的…

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒）、对病毒进行纯一提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆人ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ Ｉ双酶切法、ＰｓｔＩ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，ａｑｔ     

新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因的克隆及其酶切分析

根据已发表的新城疫病毒（ＮＤＶ）核衣壳蛋白（ＮＰ）基因序列,设计合成１对长度为３２ｍｅｒ的引物。ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＮＤＶＦ４８Ｅ８株、Ｕｌｓｔｅｒ株、ＬａＳｏｔａ株的ＮＰ基因,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均呈现１条长１．５ｋｂ左右的特异性带。将Ｆ４８Ｅ８株扩增产物克隆入ｐＵＣ１８载体,经限制性内切酶分析证实为ＮＰ基因。     

鸡新城疫病毒东北地区分离株融合蛋白基因的克隆与鉴定

以 Ｎ Ｄ Ｖ 东北地区分离株 Ｄ Ｂ３ 、 Ｄ Ｂ５ 的基因组 Ｒ Ｎ Ａ 为模板, 通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术扩增其 Ｆ 基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ,并将其克隆到质粒ｐ Ｕ Ｃ１９ 中, 转化感受态大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α, 经分子量比较、酶切分析、 Ｐ Ｃ Ｒ 等鉴定方法证明, 我们分别获得了含有 Ｎ Ｄ Ｖ Ｄ Ｂ３ 、 Ｄ Ｂ５ 株 Ｆ基因的阳性重组质粒。     

新城疫病毒F48E8株血凝素—神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获取新城疫苗病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，长约１．９３ｋｂ与预期结果相符，将其克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，经限制性内切酶分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实为新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。     

伪狂犬病病毒Fa株gI和gp63基因缺失株的构建

用限制性核酸内切酶ＮｃｏＩ消化含有伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）Ｆａ侏ＢａｍＨＩ－７片段的质粒ＰＰＢ７，以低融点琼脂糖回收目的片段，经连接并转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｄ，获得缺失３ｇＩ和部分ｇｐ６３基因的重组质粒ＰＰＢ７－１。将ＰＲＶ Ｆａ与ＰＰＢ７－１ ＤＮＡ共同转染ＰＫ１５单层细胞，待出现５０％以上细胞病变时收获病毒，并以蚀斑法得到纯化重组病毒株，命名为ＰＦＤＩ／Ｄ６３。小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一定     

新城疫F_(48)E_9株L基因克隆与鉴定

本实验根据已知新城疫病毒L基因序列分别设计了两对引物 ,引物 1(L1)、引物 2 (L2 )、引物 3(L3)、引物 4(L4)。以L1/L2为引物可以扩出 40 5 0bpF4 8E9株L基因的A片段 (LA) ,以L3/L4为引物可扩增出 35 0 4bpF4 8E9株L基因的B片段 (LB)。LA和LB 2个片段经特异性双酶切后用T4DNA连接酶连接成完整的F4 8E9株L基因并克隆到pMD18_T载体中 ,对克隆后L基因 5’端、3’端和连接点处的核苷酸序列进行了测定 ,经DNASIS软件分析表明为NDVL基因 ,证明我们获得了F4 8E9株L基因     

新城疫病毒F_(48)E_9株P基因的克隆及鉴定

根据NDVP蛋白己知基因序列设计合成了一对引物PU/PL ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株P基因 12 72bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子从 5’端进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株P基因片段 5’端的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 83 7%。至此 ,我们获得了F4 8E9株P基因的全长克隆     

新城疫病毒F48E9株HN基因核苷酸序列

本研究采用 Ｓａｎｇｅｒ＇ｓ 双脱氧末端终止法测定了新城疫病毒国内标准强毒株 Ｆ４８ Ｅ９ 血凝素神经氨酸酶基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的核苷酸序列,推导出其氨基酸序列。 Ｆ４８ Ｅ９ Ｈ Ｎ 基因编码区全长为 １７１３ｂｐ,单一的开放阅读框编码５７１ 个氨基酸的糖蛋白。含有６ 个潜在的与天门冬酰胺（ Ｎ）连接的复合寡聚糖和高甘露糖寡聚糖结合位点,其中有 ５ 个簇集在蛋白分子的 Ｃ末端一半内,有１３ 个半胱氨酸残基。发现６ 个 Ｆ４８ Ｅ９ 特有的氨基酸残基,３７ 位 Ｆ（ Ｌ）、３８ 位 Ｓ（ Ａ）、６０ 位 Ｌ（ Ｐ）、１０５ 位 Ｓ（ Ｎ）、４４３ 位 Ａ（ Ｔ）、５７１ 位 Ｉ（ Ｖ）,这些位点除了 ６０ 位的 Ｐ有两株为 Ｓ以外,其它的在 １３ 株已知序列中均为高度保守序列。     

鹌鹑新城疫病毒分离株F基因的克隆和序列分析

研究以新城疫鹌鹑分离株(LA005)的基因组RNA为模板，应用RT-PCR技术扩增出其F基因的主要功能区片段，并进行了克隆和序列分析。结果表明：所扩增的目的片段长度为813bp，裂解位点氨基酸序列为112R-T-Q-R-R-Fll7，和F48E9标准强毒株的核苷酸和氨基酸的同源率分别为98．9％和98．5％，Cys残基位点和糖基化位点的数目和位置完全一致，说明该分离毒是一株和F48E9标准强毒株亲缘关系很近的强毒株。     

新城疫病毒特异性糖蛋白基因探针的制备及应用

应用ＲＴ－ＰＣＲ获取新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的部分囊膜糖蛋白基因片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,长为９２６ｂｐ,与预期结果相符;将该基因片段定向克隆入质粒载体ＰＵＣ１９只,得到重组质粒Ｐ９２６,酶切分析结果与已发表的ＮＤＶ毒株酶切位点一致。     

3株新城疫病毒广西分离株L基因的克隆与序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒L基因序列,设计了3对引物(L1和L2、L3和L4、L5和L6)。用RT-PCR技术对3株新城疫病毒广西分离GX7/02、GX9/03、GX11/03的L基因进行了分段扩增和克隆,并对克隆出来的3个片段进行序列测定,用DNAstar软件比较分析后进行拼接,得到长约为6.8 kb、包含有L基因全长的核苷酸序列。L基因的RNA全长为6 704 bp,拥有一个6 615 bp的开放阅读框,推导其编码的氨基酸数为2 204个。氨基酸同源性分析表明广西分离株之间同源性为98.6%~98.7%;与ZJ1株同源性为98.8%~98.9%;与La-Sota、B1、F48E9、HB92同源性为92.0%~94.2%。     

Establishment of a Stable Expression Cell Line of Nucleoside Diphosphate Kinase B and Its Influence on Replication of F48E9 Strain of Newcastle Disease Virus

In order to explore the influence of nucleoside diphosphate kinase B (NDPK B) on replication and proliferation of F48E9 strain of Newcastle disease virus (NDV), the eukaryotic expression plasmid pEGFP-NDPK B was transfected into Vero cells,then we got the cell subclones by G418 screening. We identified the expression of NDPK B protein by RT-PCR, Western blotting and inverted flurescence microscope. On the basis of Vero/NDPK B cell line,we explored the influence of NDPK B on replication and proliferation of F48E9 strain of NDV by HA-HI, TCID₅₀ and Real-time PCR.The results showed that we had successfully constructed the cell line named Vero/NDPK B, which could stably express NDPK B protein, and found that NDPK B could inhibit the replication and proliferation of F48E9 strain of NDV in Vero cells.It suggested that on the basis of NDPK B,we could design and develop new drugs or antiviral synergist to prevent or treat NDV.