猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)——10年回眸

1猪瘟及C株疫苗概况猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的高度传染性疾病,给许多国家的养猪业造成了重大的经济损失[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列入须申报(Notifiable)的动物疫病名录。在国务院印发的《国家中长期动物疫病防治规划(2012~2020年)》中,将猪瘟列为5种优先防治的“一类动物疫病”之一。     

鹅细小病毒VP1蛋白氨基酸点突变在鹅胚化疫苗株毒力减弱中的关键作用

为了进一步明确各编码蛋白基因在鹅细小病毒(goose parvovirus)鹅胚化疫苗株毒力减弱中的作用,以先前构建的弱毒疫苗株感染性质粒pSYG61v和强毒株感染性质粒pLH为基础,通过重叠PCR方法,在pSYG61v和pLH质粒之间互换Rep1和VP1基因片段,获得了6个嵌合质粒pSYG-vRep1、pSYG-vVP1、pSYG-vRC、pLH-aRep1、pLH-aVP1和pLH-aRC。将质粒以绒毛尿囊膜途径转染11日龄鹅胚分别拯救出嵌合病毒。嵌合病毒的雏鹅攻毒试验表明,携带强毒株VP1基因的pSYG-vRC、pSYG-vVP1和pLH-aRep1这3个嵌合病毒对雏鹅表现出明显致病性,死亡率在75.0%~87.5%。完全携带弱毒株rep-cap编码框的pLH-aRC嵌合病毒攻毒组雏鹅无一死亡。携带强毒株Rep1基因的pLH-aVP1和pSYG-vRep1嵌合病毒攻毒组雏鹅也无一死亡,但在试验期内部分雏鹅明显生长迟缓。嵌合病毒攻毒试验结果表明,结构蛋白VP1基因的氨基酸点突变对GPV鹅胚化疫苗株的毒力减弱起着关键作用。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法的建立

本研究旨在建立猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法。根据Shimen株设计1对特异性引物,建立猪瘟病毒RT-PCR-RFLP检测方法;对20份疑似猪瘟临床样品进行检测,并对检出的山东8株流行野毒株和2株疫苗株PCR产物进行克隆与序列分析,验证上述方法。结果RT-PCR扩增片段为825bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被ApaⅠ酶切为322bp和503bp 2个片段,兔化弱毒疫苗株则不能被酶切,检测出RNA的最低浓度为0.028 6μg.mL-1;8株流行野毒株都含GGGCCC序列(ApaⅠ酶切位点),2株疫苗株相应序列为GAGCCC,不能被ApaⅠ酶切;8株流行野毒株属于基因2群,2株疫苗株与HCLV遗传关系近,为基因1群。建立了可鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP检测方法,为猪瘟的防控提供有效手段。     

猪瘟兔化弱毒(或牛体反应)疫苗的应用經驗

我县过去开展猪瘟預防注射,所用猪瘟兔化(或牛体反应)弱毒疫苗,都是由县統一接种、采毒,分块后用冰壶保存,分发到各公社防疫队,在注射前才研碎稀释,稀释后的疫苗当天用完。这样做的結果,常出現三个問题:第一,由于公社兽医設备不足,每个防疫队要找到一套无菌罩等磨苗工具,往往要花很多时間,特別是一些山区,村庄分散,道路崎岖,自带工具极感不便,要找到固定工具更感困难,不带工具又怕疫苗磨制后不安全,危害生产。第二,技术人員缺乏,无菌知識不足,加上农村設备簡陋,疫苗污染机会較多。第三,花工本大,每     

绿色荧光蛋白基因与猪瘟兔化弱毒疫苗株E2基因在杆状病毒中的融合表达

为了研究猪瘟病毒E2糖蛋白的立体结构及生物学特性，将增强型荧光蛋白基因（EGFP）和猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCI.V）E2基因经PCR扩增后克隆至pBlueBacHis2A质粒，与杆状病毒DNA共转染后经PCR鉴定获得了含有EGFP和HCLVE2融合基因（GFPTE2）的重组杆状病毒rBACTE2-339，并将其感染sf9细胞后在荧光显微镜下观察到了亮绿色荧光．说明融合基因已初步表达。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

齐卡肉兔接种猪瘟兔化弱毒(C株)的热型观察

为了查找生产中原料兔接种猪瘟兔化弱毒C株病毒后定型热比例常低于70%的原因,观察了无猪瘟病毒抗体的8个批次,共3 512只中型齐卡肉兔对猪瘟兔化弱毒C株病毒的热型反应。结果:定型热占(91.3±1.5)%,轻热(5.8±1.2)%,可疑(1.8±1.5)%,无反应(0.9±0.7)%;8个批次的试验兔,对5个毒种代次的体温反应,差异不显著(P0.05)。研究认为,来自农村养兔户的原料兔,可能接触过猪瘟病毒,致定型热比例下降;无猪瘟抗体的中型齐卡肉兔,对不同代次的猪瘟兔化弱毒C株病毒均有良好的体温反应,可作为猪瘟弱毒疫苗(脾淋源)的原料兔。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗及野毒感染对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果的影响

<正>猪瘟病毒(CSFV)为RNA单股正链病毒,属黄病毒科瘟病毒属的成员,是猪瘟的病原,危害家猪和野猪。猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病,主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重,可造成养猪业的重大损失。猪圆环病毒2型(PCV-2)为DNA病毒,属圆环病毒科圆环病毒属的成员。PCV-2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎肾病综合征、仔猪传染性     

猪瘟兔化弱毒疫苗与猪圆环病毒2型灭活疫苗同时接种的免疫效果评价

为评价猪瘟兔化弱毒疫苗和猪圆环病毒2型(PCV2)灭活疫苗同时免疫效果,本实验采用猪瘟活疫苗(细胞源)和PCV2灭活疫苗(LG株)两种疫苗同时分点注射和混合注射35日龄仔猪,于免疫后间隔3周、5周、7周、9周采血,通过猪瘟病毒(CSFV)抗体检测试剂盒和PCV2抗体检测试剂盒进行CSFV和PCV2特异性抗体检测。结果显示,无论是两种疫苗同时颈部两侧分点分别注射,还是用PCV2灭活疫苗稀释CSFV活疫苗后混合免疫,免疫后3周CSFV和PCV2抗体均呈阳性,CSFV抗体滴度和PCV2抗体滴度于7周和9周达到峰值,与各疫苗单独免疫对照组抗体产生时间和滴度无明显差异。实验表明,两种疫苗可以同时注射或采用PCV2灭活疫苗稀释CSFV活疫苗进行免疫,均不影响各自免疫抗体的产生。因此,可以将PCV2灭活疫苗作为CSFV活疫苗的稀释剂,采用一次性注射的形式同时接种这两种疫苗,为简化这两种病临床疫苗免疫注射方面提供了实验依据。     

RT-PCR法快速检测与鉴别诊断猪瘟病毒野毒株和三个兔化弱毒疫苗株的研究

基于猪瘟病毒基因组中富含T的插入序列建立起的简捷一步法RT-PCR技术,用于同步检测与鉴别野毒株和疫苗株。依据猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株3′NTR独立存在富含T的插入序列,设计特异性的扩增引物,使用简捷一步法RT-PCR或巢式PCR之后用琼脂糖凝胶电泳或多毛细管电泳方法进行分析,能检测到并且准确鉴别在临床标本中的古典猪瘟病毒野毒株和兔化猪瘟疫苗株。这些检测技术至少可用于3个兔化弱毒疫苗株LPC、HCLV和C-株的检测。野毒株RT-PCR检测限量是6.3TCID50/mL,巢式PCR检测限量是0.63TCID50/mL。在前一次研究中,在猪瘟兔化弱毒疫苗株的基因组的3′NTR发现有12～13nt的富含T的插入序列;本次研究中,在LPC/PRK和LPC/TS兔化疫苗株的基因组中发现2个长为42和36nt富含T的插入序列。这些长为12、36、42nt富含T的插入序列增加PCR片段的大小,有利于遗传标记对猪瘟病毒野毒型和不同兔化疫苗株间的快速检测和鉴别。     

兔出血症病毒CD株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆、核酸及氨基酸序列比较分析

以兔出血症病毒 CD株人工感染家兔 ,发病死亡后 ,取肝脏匀浆 ,用 Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒 RNA。根据 Gen Bank已发表序列保守区设计并合成引物 ,采用 RT- PCR方法扩增了 RHDV衣壳蛋白 VP6 0基因。将所扩增片段克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了序列测定 ,测序结果表明 ,CD株 VP6 0基因全长 174 0 bp。该序列与已发表的其他分布于世界各地的 14株 RHDV序列进行了比较和基因进化树分析。无毒株与各强毒株之间的同源性为 85 .3%～86 .5 % ,强毒株间的同源性较高 ,为 92 .1%～ 10 0 %。根据进化树可把强毒株分为 2大群 ,一群为 CD株、Iowa2 0 0 0株、0 0 - 139株、99- 0 5株 ,其余的为另一群。进一步细分 ,还可以分为 4个亚群和 7个组。但毒株之间的地域性差异并不明显。同时根据 15株 RHDV VP6 0基因的核苷酸序列推导了其所编码的氨基酸序列 ,并进行氨基酸序列的比较和亲水性、柔性区、抗原性和表面结构的比较分析。结果显示 ,各毒株氨基酸之间的的同源性在 90 .5 %～ 10 0 %之间 ,其中无毒株与各强毒株之间的同源性为 90 .5 %～ 91.9% ,强毒株间的同源性在 95 %～ 10 0 %之间 ;氨基酸变异分析未发现突变造成的 VP6 0蛋白高级结构的根本性变化     

羊免疫布鲁氏菌病基因缺失活疫苗(M5-90Δ26株)与弱毒疫苗(S2株)效果对比分析

为研究羊免疫布鲁氏菌病基因缺失活疫苗(M5-90Δ26株)和弱毒疫苗(S2株)效果,选取220只3～12月龄的布病阴性羊,随机分为3组,免疫48h内观察疫苗副反应,并在免疫7d、14d、30d、90d后采血进行抗体检测。结果显示：免疫48h内,M5-90Δ26注射组和S2口服组均未出现发烧症状,M5-90Δ26注射组1只试验羊出现采食量下降,S2口服组未见羊群采食量下降。M5-90Δ26注射组免疫7d抗体阳性率97%,免疫14d和30d抗体阳性率100%;S2口服组免疫后7d抗体阳性率49%,免疫30d抗体阳性率最高(81%);对照组未检测到布病抗体阳性。综上所述,布病M5-90Δ26在免疫后抗体水平上优于S2株,但可能存在副反应,建议免疫前观察羊状态,严格按照疫苗说明书进行免疫。     

鸡马立克氏病(MD)免疫的研究——MD病毒弱毒疫苗株的培育和免疫试验

从2个多年没有发生MD的鸡场的临诊健康鸡分离到两株MD病毒,分别命名为 K 株和 S 株。毒力测定证明这两株病毒是自然弱毒株。对经过培育的K和S株做了安全性和稳定性试验,证明对鸡是安全和稳定的,也做了免疫原性试验,同火鸡疱疹病毒(HVT)进行对比,结果证明 K株对鸡的免疫效力(81.25～93.75%)明显高于HVT(60.5%),S 株(68.75%)也高于HVT。用K株制造的疫苗做了大面积实际予防MD 的试验,注射鸡14万只以上。证明安全有效,免疫效力比HVT好。因此,K 株可以用作制造疫苗的弱毒株。     

猪瘟病毒兔化弱毒株与内蒙古分离野毒株(NMW)E2(gp55)基因的克隆与序列分析

采用反转录PCR（RT—PcR）和套式PCR（nested-PCR）扩增了猪瘟病毒兔化弱毒株与内蒙古野毒株的E2（gp55）基因，片段长约1200bp，将PCR产物与PMD-18-T载体相连接并克隆后，经酶切、PCR鉴定后进行序列测定和分析，结果显示二者的核苷酸同源性为89．7％，这一结果表明内蒙古近期流行的猪瘟野毒株与目前使用的疫苗株在E2基因上存在一定的差异。     

使用猪瘟兔化弱毒疫苗进行紧急注射和猪的几种疫(菌)苗同时注射在生产实际应用的体会

一、使用猪瘟兔化弱毒疫苗进行紧急注射的做法1968年2日我县××鎮暴发猪瘟,并迅速蔓延全鎮和毗邻。由于缺乏抗猪瘟血清,疫区又处于交通不便、人烟稠密的地方,又是一个生猪种苗基地,必須迅速控制和消灭。因此采用猪瘟兔化弱毒疫苗紧急接种,具体步驟如下: 1.立即划分疫区,馬上进行严格的隔离、封鎖、消毒。(1)将发生猪瘟的地区和病畜活动范围及污染     

猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达及鉴定

为获得大量的猪瘟病毒重组蛋白抗原,本文构建了猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域原核重组表达质粒pET-32a(+)-ABCD,对该重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达产量进行了比较分析,并采用胶体金免疫层析和蛋白质免疫印迹鉴定重组蛋白的反应原性。结果表明重组质粒pET-32a(+)-ABCD在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中均可以获得可溶性表达,目的蛋白表达量分别占总蛋白量的比例为11.4%和19.7%,大肠杆菌Rosseta(DE3)作为表达宿主菌更高效,且重组蛋白具有反应原性。该研究为猪瘟病毒重组蛋白抗原的制备提供了参考。     

四种疫(菌)苗对牦牛联合气雾免疫的研究——1.口蹄疫弱毒IB—RS2猪肾传代细胞疫苗对牦牛气雾免疫试验

自1978年以来,我们采用IB—RS2猪肾传代细胞试制口蹄疫A、O型弱毒疫苗26批,计690,000毫升,并以口蹄疫O型弱毒疫苗为核心,联合口蹄疫A型弱毒苗、牛出败弱毒苗、布氏猪型二号弱毒苗等四种疫(菌)苗(下称四联苗),对牦牛进行了联合气雾免疫试验,后又结合羊败血性链球菌弱毒菌苗、布氏干菌羊型五号弱毒菌苗,以单价、二联、三联对绵羊进行了气雾(或注射)免疫试验。先后在天峻、门源、贵南、海晏、大通等县,免疫牦牛、杂种牛38,282头,绵羊121,625只,初步证明安全。同时分别用本动物进行了各种疫(菌)苗的近期免疫效力、免疫期等项试验,初步证明气雾免疫的效果比较理想,几种苗联合免疫后无明显的相互干扰现象,联合免疫后,不论口蹄疫A