非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用

本研究基于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）vp72基因设计引物,建立了能够快速检测非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。将LAMP与OIE参考的PCR检测方法进行比较,并且应用LAMP对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测。结果显示,本研究设计的引物具有良好的特异性和敏感性,所建立的LAMP能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组,而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。因此,本研究所建立的方法能够用于非洲猪瘟的快速诊断以及防控。     

非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白基因vp73的序列,设计一对特异性检测引物,扩增片段251 bp,建立了检测ASFV的PCR方法。与OIE推荐使用的2组PCR引物进行比对试验,结果表明,3组引物的检测特异性相当,但本研究设计的引物灵敏度至少高出100倍。表明所建立的PCR方法能敏感、快速地检测非洲猪瘟病毒。     

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。     

非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立

非洲猪瘟给全球养猪业造成了严重危害,需要建立更加敏感的PCR检测方法。根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的VP72基因序列,设计PCR引物,建立了ASFV PCR检测方法。以合成的VP72基因片段为阳性对照,进行敏感性试验和特异性试验。同时与世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR引物进行对比试验。结果显示,建立的方法可用于ASFV检测,且对其他病毒检测时无交叉反应,特异性良好;敏感性可达到10-8,比OIE推荐的方法高10倍,为ASFV检测提供了一种新的PCR方法。     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法建立

为建立一种快速、准确的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,以2018年8月分离的SY18毒株P72基因序列(GenBank登录号:MH713612.1)为参考毒株,人工合成质粒标准品,命名为pcDNA3-P72,基于该毒株P72基因序列,在1627~1876 bp处设计一对特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系及条件,本研究成功建立了基于P72基因的TaqMan探针qPCR方法,并与OIE的特异性引物和TaqMan探针进行灵敏度、稳定性和特异性比较.结果显示:本研究建立的qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R^2值可达到0.9932,灵敏性最低能检测到10 copies/μL,与OIE引物扩增灵敏度相当,比普通PCR方法高100倍.该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%.这一方法为我国非洲猪瘟疫情的快速确诊提供了必要的分子诊断工具.     

动物疫情快递——赞比亚发生非洲猪瘟

2007年12月12日,赞比亚向OIE报告了非洲猪瘟疫情。疫情始于2007年11月1日,11月27日得到确诊。属于临床病例,依靠临床检查、实验室检测和尸体剖检作出诊断。病原是非洲猪瘟病毒。设在卢萨卡的中央兽医实验室（国家实验室）采用直接荧光抗体试验（FAT）检测呈阳性,南非Ondersteerpor兽医研究所（OIE参考实验室）的病毒分离试验还在进行中。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术（LAMP）建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的方法。整个反应在水浴锅中恒温进行,不需要其他昂贵仪器,30 min即可得到阳性结果,灵敏度是OIE标准PCR方法的100倍,并且与其他常见猪DNA病毒无交叉反应。该方法非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测非洲猪瘟病毒。     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法的建立

建立一种具有高灵敏度的检测非洲猪瘟病毒的微滴数字PCR方法,为非洲猪瘟的快速诊断和流行病学研究提供技术支持。在《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中提供的qPCR检测方法的基础上,建立了非洲猪瘟病毒微滴数字PCR方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法的最低检测限可达0.8copies/μL,敏感性高于qPCR方法,不与猪常见的6种病毒发生交叉反应,而且重复性较好。采用建立的微滴数字PCR和OIE的qPCR方法分别对78份临床病料进行非洲猪瘟病毒的检测,结果显示2种方法的符合率为100%。本研究建立的微滴数字PCR方法具有理想的敏感性和特异性,适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。     

非洲猪瘟病毒核酸定性检测方法比对

为提升兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测能力和质量控制水平,积累检测经验,以更好地开展非洲猪瘟检测,2020年7月,参加了北京市农业农村局组织的“非洲猪瘟实验室检测能力比对”项目。本次比对同时选用《非洲猪瘟检疫技术规范》(SNT 1559—2010标准)中的普通PCR方法、荧光定量PCR方法以及商品化试剂盒,对5份验证样品开展非洲猪瘟病毒核酸检测和结果比对。比对发现,3种检测方法结果一致,样品检测结果与预期一致,结果满意。此次比对确认了实验室现有检测方法能够满足非洲猪瘟病毒核酸的日常检测需求,同时提升了实验室人员的检测能力,积累了检测经验,可为非洲猪瘟防控提供有力的技术支撑。     

猪细小病毒的PCR检测、分离及鉴定

根据GenBank中报道的猪细小病毒基因组序列,利用PCR引物设计软件,设计并合成了1对引物,通过对PCR反应条件的优化,成功地扩增出了511bp的目的片段,建立了PCR检测PPV的方法。利用该方法对120份临床样品进行检测,共检测到4份阳性样品,并成功地分离到2株PPV,1#病毒分离株理化特性鉴定表明其符合PPV的特性。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列,设计了一对特异性引物和探针,使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法。结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性。     

基于E184L基因的非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高度接触性传染病。由于ASFV的感染机制极为复杂,基因型多,至今尚无有效疫苗用于防控,防止该病暴发主要依赖于早期快速诊断和控制。为建立一种高效快速、特异的ASFV检测方法,根据ASFV的E184L基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,建立了检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法设计的引物具有高度特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数为0.992,对ASFV核酸最低检测限为1.51拷贝,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等不存在交叉反应。建立的基于ASFV E184L基因实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异地对ASFV核酸进行定量分析,丰富了ASFV的检测方法。     

某养殖场的病死野猪ASFV实时荧光PCR检测

为了进一步做好非洲猪瘟疫情防控工作,研究用实时荧光PCR法对武威市某养殖场病死野猪的猪耳朵和猪鼻拭子样品进行了非洲猪瘟病毒检测。结果显示该养殖场病死猪耳样品和猪鼻拭子样品均无Ct值,线形为直线,表明所有被检测样品均为ASFV抗原阴性。研究为严防非洲猪瘟进入威武市奠定了坚实的技术储备,也为威武市非洲猪瘟疫情防控提供了一定参考。     

用PCR技术快速检测非洲猪瘟病毒

选择编码非洲猪瘟病毒结构蛋白ＶＰ７３的部分基因片段为模板，用ＰＣＲ技术检测非洲猪瘟病毒ＤＮＡ，电泳分离可见１条长约１ｋｂ的ＤＮＡ扩增带。本方法具有安全、快速、敏感等特点     

Development of Virus-like Particles Containing African Swine Fever Virus Nucleic Acid Sequence and Its Application in Detection Method

African swine fever (ASF) is an infectious disease caused by the African swine fever virus (ASFV). In order to ensure the accuracy and reliability of the test results,it is necessary to develop positive standard control products used in the kit. The study was aimed to develop the virus-like particles containing African swine fever virus (ASFV) nucleic acid sequence and its application in detection method. Fristly,the full-length gene fragment of p72 gene was amplified, and the ASF DNA virus-like particles containing p72 gene was constructed using insect baculovirus system. In order to further validate the reliability of the virus-like particles in the application of the method,DNA nucleic acid was extracted simultaneously with the cultured virus and infected tissue sample and applied in the Real-time quantitative PCR method. The results showed that the virus-like particles prepared by this study could replace the ASFV as a positive control product in the Real-time quantitative PCR method, and could act as quality control during nucleic acid extraction process. In the fluorescent PCR detection kit, the lowest packaging concentration of virus-like particles was 10² TCID₅₀. Further studies had shown that the virus-like particles were also suitable for common PCR and LAMP detection methods, the minimum concentration were 10³ and 10¹ TCID₅₀, respectively. The results of this study would be important for the ASF detection method, promoting the application of the method and ensuring the accuracy and reliability of the test results.     

非洲猪瘟病毒核酸检测技术与应用进展

自2018年8月以来,非洲猪瘟已成为我国养猪业的头号疫病,对养猪业造成了巨大损失。基于聚合酶链式反应(PCR)的核酸检测方法具有高灵敏性和高特异性,在对非洲猪瘟的诊断、感染监控和养殖复产过程中生物安全评价等方面发挥了重要的作用。文章对常用的核酸检测技术与特点、非洲猪瘟病毒核酸检测方法的应用、核酸检测新技术展望3个方面进行了总结,以期为养猪企业在非洲猪瘟核酸检测和监测方面提供帮助。     

非洲猪瘟病毒微芯片荧光PCR快速检测技术的建立及初步应用

非洲猪瘟缺乏安全有效的疫苗,其防控有赖于及时、准确的诊断和消毒灭源。本研究在对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L基因序列进行分析的基础上设计引物、探针,建立了基于微芯片的ASFV免提取荧光PCR检测技术。特异性试验结果显示,微芯片PCR可用于我国不同地区ASFV毒株的通用检测,对其他主要猪源病毒均为阴性;敏感性试验结果显示其检测下限为10拷贝/μL;对117份临床样品的检测结果显示,该方法可用于猪全血、淋巴结、脾脏、肌肉样本中ASFV核酸的检测,与世界动物卫生组织推荐的荧光PCR检测方法相符率达100%,且显著简化了检测操作步骤,检测用时缩短在30 min之内,获得农业农村部第一批非洲猪瘟现场快速检测试剂的推荐,应用于养殖场、屠宰场和流通环节中ASFV核酸的检测。