鄱阳湖与青海湖地区野鸟H9N2亚型禽流感病毒的生物学特性

为了解我国野鸟中H9N2亚型禽流感病毒的分布与特征,2015—2016年对鄱阳湖与青海湖地区野鸟中的H9N2病毒进行监测,结果共分离到12株H9N2亚型禽流感病毒。对分离的病毒进行HA和NA基因序列测定、受体分析和SPF鸡、Balb/c小鼠的感染性试验,结果显示:12个分离株的HA裂解位点基序均为PSRSSR/GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;HA蛋白受体结合位点处第226位氨基酸残基为亮氨酸(L),具有结合人样流感病毒受体的分子特征;受体结合试验表明,分离毒株既能结合禽样受体,也能结合人样受体;SPF鸡攻毒试验表明,分离株为低致病性毒株;Balb/c小鼠的感染性试验表明,分离株只在小鼠的上呼吸道鼻甲和肺中有限复制,未见明显临床症状。     

一株H9N2亚型禽流感病毒全基因组分析

为了研究H9N2亚型AIV A/Chicken/Guangdong/333/2008的全基因组序列变异情况,试验利用RT-PCR方法扩增出该病毒的8个基因序列,并应用DNAStar和MEGA4.0软件分析所得基因序列。结果表明:该病毒HA基因的第226位氨基酸由Q(Gln)变为了L(Leu),其NP基因与Viet Nam/1203/2004(H5N1)的NP基因同源率最高。说明该病毒已具备了感染哺乳动物的分子特征,并可能在遗传演化过程中突变为高致病性的禽流感病毒(AIV)。     

一株绿鹭源H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

为了解野生水禽绿鹭(Butorides striata)中分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(A/striated heron/Yunnan/2018)的生物学特性;对其进行全基因组序列扩增、测序、进化分析;序列分析显示:该分离株HA、NA基因位于Y280-like分支、PB2、M基因位于G1-like分支、PA、PB1、NP、NS基因位于F98-like分支,分别与H9、H7、H10等多种亚型的AIV同源性较高,该分离株不同基因片段来源较复杂。HA裂解位点氨基酸序列为333PSRSSR↓GL340,符合低致病性禽流感病毒(LPAIV)氨基酸序列特征;S145N突变增加了一个糖基化位点,提示该位点出现可能会使毒株致病性提高,免疫原性发生改变;HA受体结合位点发生Q234L突变,表现出人流感病毒受体结合特性;NA基因出现第63—65位氨基酸缺失,M1发生N30D,T215A突变,M2发生S31N的突变,PB2、PB1、NS、NP、PA关键位点未发生变化,分析结果提示当前分离株已出现耐药性、致病性增强的变化。本研究表明该分离株呈现遗传演化的多样性及基因重组的复杂性,因此加强对野生水禽类禽流感病毒的监测和研究具有重要的公共卫生意义。     

3株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列进化分析

为明确3株不同源性的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Jilin/22/13(简称JL22)、A/Chicken/Jilin/24/13(简称JL24)、A/Duck/Jilin/37/13(简称JL37)基因组的遗传变异情况,本试验采用RT-PCR技术,分别扩增出3株AIV的8个基因片段,克隆后进行序列测定。结果显示,3株H9N2亚型AIV的主要致病基因均属于经典的欧亚种系。氨基酸比对发现JL22的HA氨基酸序列与A/Chicken/Hong Kong/G9/97和A/Duck/Hong Kong/Y280/97的HA氨基酸序列相比,在551位多了1个潜在糖基化位点。JL22、JL24、JL37的HA序列,在226位的氨基酸残基均为Leu,具有同哺乳动物唾液酸受体结合的特性,说明对人的感染性增强。M基因在31位上均发生了Asn取代Ser的现象,说明这些病毒对金刚烷胺产生了耐药性。由系统进化树可知3株毒株亲缘关系较远,各个基因所属分支也不具有统一性,且部分基因分别与鸡源、鸭源和猪源3种源性流感病毒株高度同源,推测这3株毒株是不同动物不同毒株经过长时间进化而发生自然重排的产物。     

三株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

采用RT-PCR对3株H9N2亚型禽流感病毒基因组进行扩增,测序后再利用DNAStar和MEGA 4对所得到的序列和部分具有代表性的参考序列进行遗传演化及分子特点分析,旨在从分子水平探讨华南地区H9N2亚型禽流感病毒的流行特点,为该病的综合防控提供依据.结果表明,3个分离株CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05与CK/GD/A8/10分别属于B34、B47和B54基因型;3个分离株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9N2亚型AIV HA基因的遗传进化特点,但内部基因出现不同程度重组且部分基因与人源高致病性H5N1亚型AIV同源性很高;CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05两株分离株具有宿主多样性.因此,对华南地区H9N2亚型AIV进行监控及分子流行病学调查具有重要意义.     

广东一株重组H9N2亚型禽流感病毒的鉴定及全基因组序列分析

本研究于2013年从广东某发病鸡场分离到一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangdong/LG1/2013.对病毒进行全基因组克隆测序和进化分析,其HA基因裂解基序为333pSRSSR ↓ GLF341,呈典型低致病性AIV分子特征.其HA基因发生Q226突变和A316S突变,NA基因出现第63～65位氨基酸缺失.该病毒株HA、NA和NS基因属于类BJ/1/94分支,PB2属于类SD/H/09分支,PB1、PA、NP基因属于类SH/F/98分支,M基因属于类HK/G1/97分支,该基因型在广东地区未见报道,其内部基因与H7N9亚型人流感病毒SH/02/2013株核苷酸同源性在95.6 ％～98.6％之间.本研究表明我国H9N2亚型AIV呈现遗传演化的多样性及基因重组的复杂性,对该亚型病毒的监测和研究具有重要的兽医和公共卫生意义.     

两株H9N2亚型禽流感病毒的基因组序列分析及其对小鼠的致病性研究

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2019年自青海省活禽市场家禽拭子和青海湖野鸟粪便中各分离到的一株H9N2亚型AIV,CK/QH/S1182/2019株和WB/QH/S1355/2019,并进行了病毒基因组序列测定、遗传演化分析和BALB/c小鼠致病性试验.HA序列分析显示,两株病毒的HA裂...     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒,经血凝抑制试验(HI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明,3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明,该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支,与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高,同源性为99.5%。     

新疆艾比湖野鸟H1N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

旨在调查野鸟中存在的禽流感病毒,并为禽流感的防制提供依据。采集新疆艾比湖自然保护区野鸟的粪便棉拭子进行禽流感病毒的分离与鉴定,将PCR产物进行纯化后用T载体连接并转化到DH5α细胞中;菌液PCR鉴定后将目的菌液送至上海生工测序并比对测序结果,在NCBI上进行基因序列分析。结果显示,从新疆艾比湖自然保护区野鸟的粪便棉拭子分离得到1株H1N2亚型禽流感病毒;经序列分析得知,该毒株为1株低致病性禽流感病毒,且存在与多种亚型病毒的重配现象。     

H9N2亚型禽流感病毒西藏分离株的全基因组遗传进化分析

根据GenBank登陆的H9N2亚型AIV全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR的方法获取了3株H9N2亚型AIV西藏分离株A/Chiken/Tibet/S1/2009、A/Duck/Tibet/S2/2009和A/Chiken/Tibet/S4/2009的8个基因序列,并对所得序列进行同源性及遗传进化分析.结果显示,分离毒株的各基因片段均有完整的开放阅读框,HA基因裂解位点处均为RSSR/G,符合低致病性禽流感的特征;3株西藏分离毒株之间同源性为98%～99%,可能起源于同一种系;各分离毒的HA、NS和NA基因与欧亚分支A/Chiken/Beijing/1/94分支中的A/Duck/HongKong/Y280/97遗传距离最近,而M、NP、PA、PB1和PB2基因与欧亚分支中另一分支A/Quail/HongKong/G1/97群系遗传关系近.由此可见3株分离株的各基因所属分支不具有统一性,说明本研究所分离的3株H9N2亚型AIV西藏分离毒株可能是来源于不同亚系AIV的毒株在感染同一种宿主时发生基因重排的产物.     

两株野鸟源H6N1和H6N8亚型禽流感病毒的遗传进化分析和对小鼠的感染性研究

为了解2016年在江西省鄱阳湖野鸟中分离的两株H6N8和H6N1亚型禽流感病毒(P419和P339)的生物学特性,本研究对其进行了全基因组序列测定、受体分析和对BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析结果显示,这2个毒株属于不同的分支,并经历了不同亚型病毒间的广泛重组。2个分离株的HA裂解位点基序均为PQIETR/GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白受体结合位点处第138、226、228位氨基酸残基分别为丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G),具有结合禽样流感病毒受体的分子特征。受体结合试验表明,分离毒株仅能结合禽样受体。Balb/c小鼠的感染性试验结果显示,分离株只在小鼠的上呼吸道鼻甲中进行有限复制,使小鼠体重发生轻微变化,未表现明显临床症状,表明这2株分离株可感染小鼠,但致病力不强。     

禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立

研究建立了禽流感病毒（AIV）A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及HS／N1、H9／N2、A／H5／Nl多重RT-PCR检测技术，用于检测或同时检测和鉴别A型及H5N1、H9N2亚型AIV。所建立的RT-PCR和多重RT-PCR从核酸提取、基因扩增到产物分析在3～4h内即可完成，经对36株AIV及相关病毒分离物检测，与病毒分离鉴定的结果完全一致，且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用多重RT-PCR检测80份棉拭子样品，并与病毒分离鉴定方法比较，二者H5N1、H9N2亚型的鉴定结果完全吻合。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异等优点，为临诊样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。     

H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及表达

根据已知H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因序列设计,合成克隆引物。自H9N2亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增NA基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTMpETdirectionalTOPOexpressionsystem)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组NA,分子量约54·7ku。经免疫印迹及ELISA分析重组NA的免疫反应性和免疫动物分析其免疫原性,结果表明:重组NA能与H9N2亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免疫动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性。     

H9N2亚型禽流感病毒人工感染蛋鸡的组织病理学研究

本研究用H9N2亚型禽流感病毒人工感染蛋鸡,对感染蛋鸡的组织病理学进行了观察,结果发现接毒后第3d,主要病理变化为全身各组织的广泛性充血、出血以及肝脏、肾脏的变性、坏死;肝、肾组织的Mann亚甲蓝伊红染色发现肝细胞、肾小管上皮细胞胞浆内有嗜酸性包涵体;红细胞凝集抑制试验(HI试验)检查结果表明鸡接毒3 d后,HI抗体开始呈上升趋势.     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

H9N2亚型禽流感病毒感染对小鼠肠道菌群的影响

本研究旨在探究H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)感染对小鼠肠道菌群的影响.选用24只SPF级BALB/c雄性小鼠,随机平均分为对照组和感染组,对照组小鼠鼻腔接种正常尿囊液,感染组小鼠鼻腔接种含有1.2×105 PFU H9N2 AIV的尿囊液.收集对照组小鼠在第0、33天和感染组小鼠在感染后第4、8、21和33...     

2019年上海地区H9N2禽流感病毒分子特征及演化分析

为了解上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株的遗传变异情况,本研究对2019年分离的4株H9N2AIV的8个基因节段进行PCR扩增、克隆和测序,并对获得的8个基因序列进行同源性以及基因进化分析,对与病毒适应性增加的关键氨基酸位点进行了分析,并和目前我国使用的H9N2流感疫苗毒株HA上的抗原位点进行了比较....     

H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究

对1998—2002年间在河南省豫北地区分离到的5株H9N2亚型禽流感病毒的抗原性变异进行了研究。经HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验及攻毒保护试验证明，5株H9N2亚型间已经发生了抗原性漂移。98A5和99S毒株间的保护力接近100％，HI试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验的相关性均在0．74以上。表明2毒株间的抗原性相近；用00Y毒株攻击其他4株免疫的鸡，其保护率仅为60％～80％；而02Y株对除00Y株外的4株的免疫保护率分别为60％、75％、80％、100％，与分离年代呈负相关性，HI、鸡胚中和试验、细胞中和试验也取得类似结果，说明2000年后的毒株间已发生抗原性变异。