藏獒犬白介素18基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR技术从刺激的藏獒犬外周血淋巴细胞中成功克隆白介素18基因全长,其大小为582bp,编码194个氨基酸。与GenBank上发表的犬IL-18(NM001003305)比较,序列的同源性为100%,与犬、猫、猪,牛、羊、人的IL-18基因核苷酸同源性分别为100%、91.2%、91.1%、88.5%、89.3%、84.4%。系统进化树可以看出,藏獒犬基因与犬的亲缘关系最近,与猫的其次,与人是较远的。然后构建-IL18去信号肽的原核表达载体pET-30a-IL18,转化BL2L,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出25kd融合蛋白而且目的蛋白主要以包涵体的形式存在,westbloting验证表达的蛋白正确。     

猫干扰素基因的克隆表达及其活性测定

根据已知人、马、牛、羊、兔、鹿等物种体内IFNω的基因序列分析,设计引物进行扩增。将扩增基因克隆于原核表达载体pET-His。将重组表达载体转入宿主菌进行诱导表达,表达产物以包涵体的形式存在,大小约为20kDa,表达量达到28%。将表达产物复性纯化处理后加入猫肾上皮细胞(CRFK),用水泡性口炎病毒(VSV)攻毒,测出重组IFNω的生物活性达到1.64×106U/mg,重组蛋白质的含量约为18mg/L。     

葡萄球菌肠毒素C基因的克隆表达及其生物学活性鉴定

为表达和纯化金黄色葡萄球菌(金葡菌)超抗原毒素,本研究从金葡菌中克隆葡萄球菌肠毒素C2(sec2)基因,构建了表达葡萄球菌肠毒素C与谷胱甘肽硫转移酶(GST-SEC)融合蛋白的重组质粒(pGEMSEC),通过大肠杆菌表达、亲和纯化、酶切、再亲和纯化,建立了便于大量制备高纯度的重组SEC(rSEC)的简便方法.此外,通过酶联免疫试验及双向琼脂扩散试验检测了rSEC免疫反应性,并通过测定rSEC刺激鼠脾细胞产炎性因子来检测了rSEC的超抗原活性.结果表明,rSEC与野生型SEC具有相同的免疫反应性和超抗原活性,为在今后对该超抗原进行进一步应用性开发和构建定点减毒诱变奠定了工作基础.     

牦牛干扰素tau基因的克隆表达及其活性测定

作为Ⅰ型干扰素,IFN-tau具有很高的抗病毒和抗增殖活性和免疫调节等功能,近年来研究还发现IFN-tau具有较高的抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)复制的活性[1].与其他干扰素不同的是IFN-tau仅在反刍动物妊娠发育初期的胚胎滋养层细胞中表达,无需病毒诱导,有延长黄体发挥功能的时间的作用.     

猫ω干扰素基因的克隆表达及其活性测定

根据已知人、马、牛、羊、兔、鹿等物种体内IFNω的基因序列分析,设计引物进行扩增。将扩增基因克隆于原核表达载体pET-His。将重组表达载体转入宿主菌进行诱导表达,表达产物以包涵体的形式存在,大小约为20kDa,表达量达到28%。将表达产物复性纯化处理后加入猫肾上皮细胞（CRFK）,用水泡性口炎病毒（VSV）攻毒,测出重组IFNω的生物活性达到1.64×106U/mg,重组蛋白质的含量约为18mg/L。     

梅花鹿γ干扰素克隆表达及抗病毒活性测定

提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为梅花鹿γ干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%.将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠埃希菌BL21中实现了高效表达.表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的32.6%.用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性,重组梅花鹿γ干扰素抗病毒活性分别约为7.25×104 U/mL和4.61×104 U/mL.结果表明,重组梅花鹿γ干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定.     

脾源樱桃谷鸭IFN-γ基因的克隆、表达及活性测定

目前,鸭病毒性疾病如番鸭细小病毒病、鸭病毒性肝炎、鸭瘟等给养鸭业造成严重的经济损失,因此研究高效、广谱、抗病毒、无药物残留的生物制剂势在必行.研究从新城疫病毒刺激的鸭脾淋巴细胞培养液中提取基因组,采用RT-PCR技术扩增鸭γ-干扰素基因,克隆并在原核细胞中进行了表达和抗病毒活性测定,以期为其在动物体内的应用打下基础.     

猫白介素18基因的克隆、表达及其产物的生物学活性分析

白介素18(IL-18)可以诱导IFN-γ分泌,促进T、B淋巴细胞的增殖分化,具有良好的抗病毒活性。为探究猫IL-18的生物学活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)联合poly I:C共同刺激实验猫,采用常规方法分离猫脾淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法获得大小为579 bp的猫IL-18基因。构建了可溶性表达猫IL-18的重组大肠杆菌pCold-IL-18/BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果显示,重组菌表达了约70 ku的重组蛋白。重组蛋白经3C蛋白酶处理后并通过Ni柱亲和纯化,获得了可溶性表达的重组猫IL-18(rIL-18)。取BALB/c小鼠和猫的脾淋巴细胞,经不同浓度rIL-18刺激,采用MTT法检测rIL-18促进淋巴细胞增殖活性,结果显示可溶性表达的rIL-18能够有效地促进淋巴细胞增殖;采用细胞病变抑制法检测rIL-18协同干扰素的抗病毒效果,结果显示rIL-18联合临床用干扰素可显著增强抗病毒效果。本研究为治疗猫病毒性疾病奠定了物质基础。     

九龙牦牛PPARγ基因的克隆及其表达谱分析

根据普通牛(Bos tarus)过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因序列设计引物,用成年九龙牦牛(Bos grunniens)脂肪组织总RNA,经RT-PCR扩增获得了PPARγ基因序列(GenBank登陆号:GU061328),其中cDNA的ORF为1 428 bp,编码475个氨基酸,与普通牛PPARγ氨基酸的同源性达99%,有2个氨基酸发生突变。利用半定量RT-PCR分析九龙牦牛PPARγ基因的mRNA表达特性。结果表明:在脂肪、背最长肌、心、肝、肾、脾和肺脏中均检测到PPARγ基因的表达,并且在脂肪组织中表达量极显著高于其他组织(P0.01),在肝脏和脾脏中亦有较高表达。PPARγ基因在背最长肌中的表达5.5岁九龙牦牛显著高于0.5、3.5岁和9岁以上,其表达与背最长肌的肌内脂肪含量未见显著相关性。     

犬γ干扰素基因的克隆与序列分析

根据已发表的犬γ干扰素（Ｃａ－ＩＦＮ－ｒ）ｃＤＮＡ序列设计引物,用植物血凝素（ＰＨＡ）有机锗（Ｇｅ－１３２）刺激体外培养的犬脾细胞产生ＩＦＮ,提取ＩＦＮｍＲＮＡ,并以其为模板进行返转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出４８０ｂｐ基因片段。经酶切鉴定后将其克隆到ｐＵＣ１９的ＳｍａⅠ,构建重组质粒ｐＵＣ．ＩＦＮ。经酶切、ＰＣＲ及序列分析鉴定,可证明克隆的基因为犬γ干扰素,与所发表的核苷酸序列同源率为９     

犬干扰素-γ的可溶表达及其产物的活性鉴定

为研究犬干扰素-γ(CaⅢN-γ)的可溶表达,本研究应用SUMO表达系统高效稳定、可溶地表达了SUMO-CaIFN-γ蛋白.以MDCK细胞为靶细胞,MTT法检测CaIFN-γ对该细胞增殖的抑制作用.结果表明,CaIFN-γ对MDCK具有明显的抑制作用.Real time法检测CaIFN-γ刺激MDCK细胞后,细胞内源p53 mRNA水平的变化,结果显示,p53的表达量与CaIFN-γ的剂量和时间呈依赖性关系.本研究为进一步研究CaIFN-γ的生物学特性、研制新型CaIFN-γ用于我国犬类疾病的治疗及CaIFN-γ生物制剂的生产奠定了基础.     

猪γ-干扰素基因的克隆 原核表达及抗病毒活性检测

干扰素(IFN)是一类具有抗病毒、抗肿瘤、激活淋巴细胞和免疫调节等多项功能的细胞因子,在机体免疫系统中发挥重要作用.猪γ-干扰素(γ-IFN)主要是由被激活的T细胞和NK细胞产生[1].     

金黄色葡萄球菌FnBA活性基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(FnBA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了1 735 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-FnBA.以HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-T-FnBA和pET28a(+),将纯化的基因FnBA亚克隆至pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET28a-FnBA,并将其转化至E.coli BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约85 000处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带.又经Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性.     

牛γ干扰素基因的表达及其多克隆抗体的制备

为了获得牛γ干扰素表达产物及其多克隆抗体,利用分子生物学软件分析GenBank公布的牛γ干扰素的氨基酸序列,针对这一基因序列设计了一对特异性引物,并从牛脾脏淋巴细胞提取基因组总RNA,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出IFN-γ基因,与pMD18-T载体连接后进行酶切、PCR扩增以及序列测定和分析,并将...     

H9亚型禽流感病毒HA1基因的克隆表达及其生物学活性的初步分析

根据GenBank已发表序列设计引物，通过RT-PCR成功获得了H9亚型禽流感病毒北京分离株A／Chicken／Beijing／1／96（H9N2）的HA1片段，经序列分析HA1片段与其他已发表序列同源性为95％～98％。将HA1片段克隆入pET．28a的多克隆位点构建重组质粒pET28-H9HA1并转化宿主菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实，H9HA1片段得到表达，并且表达的蛋白带分为42Ku和23Ku两条。血凝实验和血凝抑制实验表明原核表达的HA1蛋白不具备血凝活性，其阳性血清不能引起血凝抑制。交叉反应实验证实原核表达的重组蛋白能与禽流感病毒H9亚型单特异性血清反应，而与禽流感病毒H5、H7亚型以及其他禽传染病病原微生物单特异性血清无交叉反应。说明表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性，有开发成为H9亚型禽流感检测试剂的可能。     

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定

根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列，设计合成了1对特异性引物，以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板，利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因（1035bp），将其克隆到pET-32a（＋）载体上，构建了原核表达载体pET—HA，表达并纯化了重组蛋白，通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示，表达并纯化的Hpg HA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合，并且可以凝集鸡红细胞。表明，成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体，并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg—HA融合蛋白。     

犬IL-29基因的克隆与原核表达

<正>干扰素(interferon,IFN)作为细胞因子超家族中的一员,具有抗病毒感染、抑制肿瘤生长、调节机体免疫功能、抗细菌和寄生虫等作用[1],成为当今分子生物学、免疫学研究中非常活跃的领域之一。白细胞介素29(Inter Leukin,IL-29)是近年来新发现的一种细胞因子,它属于IL-28家族的成员,虽然在基因结构上与IL-10很相似,但是氨基酸水平与Ⅰ类干扰素(IFN)更接近[2-9],因此也有Ⅲ类干     

禽流感病毒核蛋白基因的原核表达及其生物学活性分析

禽流感病毒(A v ian in fluenza v irus,A IV)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染或/和疾病综合征[1,2],是被世界动物卫生组织(O IE)确定的I类烈性传染病。该病自1878年在意大利鸡群首次暴发以来,已对养殖业造成了严重的经济损失。近年来,我国各地及世界上许多国家都有禽流感     

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性分析

为了找到一种获得鸡白细胞介素-18(IL-18)活性蛋白的简便方法,试验采用基因工程的方法,以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆鸡IL-18成熟蛋白基因并进行序列分析。将鸡IL-18成熟蛋白基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,构建原核表达质粒,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组鸡IL-18蛋白在大肠杆菌中的表达,经葡聚糖凝胶层析柱纯化后,用3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测表达重组蛋白的生物学活性。结果表明:鸡IL-18成熟蛋白基因开放阅读框为510 bp,编码170个氨基酸;所获得的鸡IL-18成熟蛋白基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%;成功地构建了pGEX-IL-18原核表达质粒,表达的重组蛋白质量约为45.6 ku,该重组蛋白具有明显增强鸡脾淋巴细胞增殖的生物学活性。