基于label-free技术的梅花鹿(Cervus nippon)茸角蛋白组分比较

旨在探究不同生长时期梅花鹿鹿茸的蛋白质组分信息,为鹿茸有效活性物质的挖掘提供理论依据。本研究利用label-free蛋白质组学技术及生物信息学方法对不同生长时期(10、20、40、60、130与360天)梅花鹿茸角蛋白质组分进行比较研究。结果显示,梅花鹿茸角含有丰富的蛋白质,10、20、40、60、130与360天蛋白质含量依次为65.35、70.90、74.00、82.25、56.00、28.02 mg·g~(-1)。应用label-free蛋白质组学技术共鉴定出636种梅花鹿茸角蛋白质,其中218种蛋白质为显著差异表达,主要参与了蛋白质合成、发育、细胞骨架、转运等生物学过程。不同生长阶段茸角的蛋白质表达有各自的特点,为梅花鹿茸角药理活性成分的筛选及茸角相关产品的开发奠定理论基础。     

基于蛋白质组学技术的鹿茸不同部位差异蛋白筛选

旨在了解梅花鹿鹿茸不同部位蛋白表达差异,本研究以腊片部位、血片部位和骨片部位的梅花鹿鹿茸组织为试验材料,运用双向电泳(2-DE)和MALDI-TOF-TOF串联质谱技术对不同部位梅花鹿鹿茸差异表达蛋白质进行鉴定,并对差异蛋白进行生物信息学分析。结果表明,成功筛选出37个差异表达蛋白,主要涉及多细胞生物体发生、解毒、细胞成分组织或生物发生、细胞聚集、定位、对刺激的反应、生物黏附、发育、单一生物体发生、免疫系统等生物学过程。其中鹿茸腊片、血片、骨片组织中分别有18、5与14个蛋白质表达上调。对差异表达蛋白作进一步分析发现,转录延伸因子(EFB1)、视黄酸结合蛋白(CRABP1)在鹿茸的快速生长中起重要调控作用,而载脂蛋白A1(APOA1)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、转甲状腺素蛋白(TTR)在鹿茸的快速骨化中起重要的调控作用,对鹿茸快速生长与骨化机制的进一步研究具有重要意义。     

鹿茸的采收与初步加工技术

鹿茸就是骨化前的鹿角，内含有丰富的鹿茸精，具有生精补髓、益血壮阳、强筋健骨等功效，经济价值很高。1鹿茸的生长与采收1．1鹿茸生长发育的规律鹿茸是公鹿额顶生长的嫩角。末端钝圆，外面被有绒状的茸毛，内部是结缔组织和软骨组织，其间遍布血管。茸皮脱去后骨化而形成实心的骨质角，谷称鹿角。初生仔鹿的额顶两侧有色泽较深、皮肤稍有皱褶及旋毛的角痕，雄性的则更为明显。随着个体发育到一定的年龄（梅花鹿约在8～10月龄），公鹿在该处渐渐长出呈笔杆状的嫩角，上有细密的茸毛，称为初生茸。该茸角生长到一定时间，茸角表皮经摩擦而剥…     

TMEM219基因可变剪切体相对表达量及其对鹿茸重量的影响

试验旨在研究TMEM219基因3种剪切体在不同重量鹿茸尖端的表达规律及TMEM219基因表达对鹿茸重量的影响,以期探究TMEM219基因对鹿茸生长发育的调控机理。利用实时荧光定量PCR技术对TMEM219基因及其3种剪切体在同一重量组鹿茸的不同组织及不同重量组鹿茸的同一组织mRNA的相对表达水平进行检测,同时测定并比较不同产茸量梅花鹿的血清中胰岛素生长因子1（IGF-1）和胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP-3）的浓度。结果表明,TMEM219基因的3种剪接体在梅花鹿鹿茸的间充质及前成软骨组织（RP）、过渡组织（TZ）及软骨组织（C）中均有表达,TMEM219-918基因相对表达量极显著高于TMEM219-1005与TMEM219-1960基因（P<0.01）,TMEM219-1005与TMEM219-1960基因相对表达量无显著差异（P>0.05）;高重量组TMEM219基因表达量显著高于低重量组（P<0.05）;同时,高重量组个体血清中IGF-1浓度显著高于低重量组个体（P<0.05）,而IGFBP-3浓度显著低于低重量组个体（P<0.05）。结果提示,TMEM219基因高表达可能会促进鹿茸的生长,增加鹿茸重量;推测其可能的机理是TMEM219竞争性结合IGFBP-3,减少与其结合的IGF-1,加强IGF-1与IGF-1R的亲和力,进而提高IGF-1对鹿茸生长的促进作用。TMEM219基因可能成为影响鹿茸生长发育的候选基因,为提高鹿茸生长提供理论基础。     

细胞周期蛋白D1在梅花鹿茸角中的表达

以梅花鹿为研究对象,通过原位杂交方法对细胞周期蛋白D1（cyclin D1）在梅花鹿茸角中的表达进行了研究。结果显示,cyclin D1在梅花鹿茸角表皮层内表达极少,在茸角真皮层、间充质层及软骨层等处均有表达,但在表达强度上存在差异。在真皮层中,cyclin D1在真皮成纤维细胞中有较强的表达,在鹿茸间充质细胞中也有少量cyclin D1的表达,在鹿茸软骨层中,cyclin D1在软骨细胞中的表达量非常高,主要表达在增殖区的软骨细胞中。结果表明,cyclin D1可能在梅花鹿茸角再生过程中起重要的调控作用。     

原癌基因c-myc在塔里木马鹿茸不同生长期的表达

为探讨原癌基因c-myc对鹿茸生长的调控作用,选择3头成年塔里木马鹿生长期为30、60d的新鲜鹿茸,剖分成茸皮层、间充质细胞层、成软骨细胞层和软骨细胞层。首先用2种免疫组化的方法进行基因表达定位,然后通过荧光定量PCR技术对不同组织基因表达定量进行分析。结果显示：该基因在茸皮的毛囊内根鞘、毛母质和皮脂腺呈阳性反应,在动脉血管的环形平滑肌、真皮乳头层与表皮基部连接的基底层呈阳性反应。在静脉血管、神经和其他附属器反应均呈阴性。定量分析结果表明c-myc基因在不同生长阶段不同组织层均有表达。茸皮层从生长期30～60d,c-myc表达下调,而在其他3个组织中均上调表达;同一生长期茸皮和软骨层的表达量均高于间充质细胞层和成软骨层（P〈0.05）;不同生长期30、60d组织间基因的表达没有显著的变化。研究结果表明,c-myc基因在鹿茸快速生长期参与了茸皮的增殖与分化;在软骨组织中高表达特别是生长后期,说明原癌基因c-myc对马鹿茸软骨发育及骨形成有着一定调控作用。     

原癌基因c-fos在塔里木马鹿茸组织中表达特性的研究

为探讨原癌基因c-fos对鹿茸生长的调控作用,采用3头成年塔里木马鹿Cervus elaphus生长期为30、60d的新鲜鹿茸,剖分成茸皮层、间充质细胞层、成软骨细胞层和软骨细胞层。首先用2种免疫组化的方法进行基因表达定位,然后通过荧光定量PCR技术对不同组织基因的表达进行定量分析。免疫组化分析结果表明,该基因在茸皮的毛囊内根鞘和毛母质及皮脂腺、动脉血管的环形平滑肌处呈阳性反应;真皮乳头层与表皮基部连接的基底层呈阳性反应。在静脉血管、神经和其他附属器反应均未观察到阳性细胞。在间充质细胞层、成软骨层和软骨层2种方法均没有观察到c-fos的阳性表达细胞。定量分析发现,c-fos基因在不同生长阶段不同组织层均有表达,且在茸皮的表达量显著的高于间充质细胞层,成软骨层和软骨层(P<0.05)。在同一生长期间充质细胞层、成软骨层和软骨层c-fos的表达量很低;生长30与60d比较,c-fos在间充质细胞层和成软骨层变化不大,在茸皮层和软骨层表现为下调表达。本研究表明c-fos基因在鹿茸快速生长期参与了茸皮干细胞的增殖与分化,并对成骨细胞的分化起着调控作用。     

梅花鹿茸水溶性蛋白质的浸提及含量测定

建立考马斯亮蓝显色法(Bradford法)测定梅花鹿茸水溶性蛋白质含量的方法,研究鹿茸不同规格和部位水溶性蛋白含量的变化;比较干燥和超微粉碎加工法对梅花鹿茸水溶性蛋白含量的影响。采用建立的Bradford检测法,以水溶性蛋白含量为指标,对梅花鹿茸的浸提方法,超声波次数,超声波方式进行比较选择,确定最佳浸提条件为0.1 g的鹿茸粉,加入pH 7.4的PBS(0.01 mol/L)4 mL,37℃浸提30 min,4℃冷浸24 h,超声波130 W 4 min处理3次,4℃,6 800 r/min离心8 min。结果表明:梅花鹿茸二杠茸水溶性蛋白为59.275~648.225μg/mL,梅花鹿三杈茸水溶性蛋白为55.878~683.721μg/mL。二杠茸高于三杈茸;烘干二杠茸不同部位的含量变化为粉片高于蜡片,腊片高于纱片和骨片,纱片和骨片相近;冻干茸高于烘干茸;3种超微粉碎鹿茸间水溶性蛋白含量差异不显著。     

Bcl-2在梅花鹿茸角中的表达

鹿茸角是哺乳动物唯一的失去后还能完全再生的器官,人们对鹿茸角再生的分子机理了解甚少。本试验以梅花鹿为研究对象,通过原位杂交方法对Bcl-2在梅花鹿茸角中的表达进行了研究。结果显示,Bcl-2在梅花鹿茸角表皮层内表达甚微,在茸角真皮层、间充质层及软骨层等处均有表达,但在表达强度上存在一定差异。在真皮层中,Bcl-2在真皮成纤维细胞中有较强的表达,在鹿茸间充质细胞中也有少量Bcl-2的表达;在鹿茸软骨层中,Bcl-2在软骨细胞中的表达量很高,主要表达在增殖区的软骨细胞中。这表明Bcl-2可能在梅花鹿茸角再生过程中起重要的调节作用。     

梅花鹿Smad2与Smad4基因的克隆及其在鹿茸顶端组织的表达

为了从梅花鹿鹿茸顶端组织中克隆Smad2与Smad4基因的编码区(CDS)序列,分析其分子特性及在鹿茸顶端不同组织中的表达情况,试验采用TRIzol法提取鹿茸顶端组织总RNA,以PCR方法获得Smad2与Smad4基因,并利用生物信息学软件对其进行生物信息学分析,免疫组化法检测Smad2与Smad4基因在鹿茸顶端不同组织中的表达水平。结果表明:Smad2基因完整的CDS序列长度为1 404 bp,编码467个氨基酸,与牛、人、马和猪的Smad2核苷酸序列同源性分别为98.29%、94.52%、95.30%和95.51%;Smad4基因完整的CDS序列长度为1 662 bp,编码553个氨基酸,与牛、人、马和猪的Smad4核苷酸序列同源性分别为98.26%、94.89%、95.85%和95.97%;Smad2与Smad4蛋白的分子质量分别为52.24 ku与60.50 ku,理论等电点分别为6.13与6.50,均具有较强的亲水性;梅花鹿Smad2与Smad4基因在茸皮层、间充质层和软骨层中均有表达,在软骨层中表达水平较高。说明梅花鹿Smad2与Smad4基因在鹿茸软骨层中表达水平较高,对鹿茸再生发育具有一定的调节作用。     

生茸期梅花鹿蛋氨酸螯合铜需要量的研究

为探讨生茸期梅花鹿日粮中铜的最适宜添加范围,将20只2岁雄性梅花鹿随机分成A、B、C、D共4组,每组5只。A组饲喂不添加铜的全价颗粒料,B、C、D组在全价颗粒料的基础上分别添加15、40、80 mg/kg蛋氨酸螯合铜。结果:梅花鹿生茸期日粮加铜,改善了营养物质消化率,除干物质外,对其他营养物质消化率影响均达到显著或极显著水平(P<0.05或P<0.01),变化趋势40 mg/kg时发生改变;梅花鹿生茸期日粮中添加铜对血液生化指标有影响,其中对血清铜蓝蛋白活性影响最为显著(P<0.05),当日粮铜添加量为40 mg/kg时,其活性达到最大值;梅花鹿日粮加铜,对血清及毛中铜含量影响显著(P<0.05);梅花鹿鹿茸产量随日粮加铜量的增加呈现先上升后下降的趋势,在日粮铜添加量为40 mg/kg时,茸产量达到最大值;梅花鹿鹿茸氨基酸含量随日粮加铜量的增加而增加,鹿茸含铜量随铜水平的增加呈现先上升后下降状态。综合各项指标,梅花鹿生茸期日粮铜的适宜添加量为40 mg/kg。     

TMEM219基因可变剪切体相对表达量及其对鹿茸重量的影响

试验旨在研究TMEM219基因3种剪切体在不同重量鹿茸尖端的表达规律及TMEM219基因表达对鹿茸重量的影响,以期探究TMEM219基因对鹿茸生长发育的调控机理。利用实时荧光定量PCR技术对TMEM219基因及其3种剪切体在同一重量组鹿茸的不同组织及不同重量组鹿茸的同一组织mRNA的相对表达水平进行检测,同时测定并比较不同产茸量梅花鹿的血清中胰岛素生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)的浓度。结果表明,TMEM219基因的3种剪接体在梅花鹿鹿茸的间充质及前成软骨组织(RP)、过渡组织(TZ)及软骨组织(C)中均有表达,TMEM219-918基因相对表达量极显著高于TMEM219-1005与TMEM219-1960基因(P0.01),TMEM219-1005与TMEM219-1960基因相对表达量无显著差异(P0.05);高重量组TMEM219基因表达量显著高于低重量组(P0.05);同时,高重量组个体血清中IGF-1浓度显著高于低重量组个体(P0.05),而IGFBP-3浓度显著低于低重量组个体(P0.05)。结果提示,TMEM219基因高表达可能会促进鹿茸的生长,增加鹿茸重量;推测其可能的机理是TMEM219竞争性结合IGFBP-3,减少与其结合的IGF-1,加强IGF-1与IGF-1R的亲和力,进而提高IGF-1对鹿茸生长的促进作用。TMEM219基因可能成为影响鹿茸生长发育的候选基因,为提高鹿茸生长提供理论基础。     

梅花鹿茸不同生长阶段顶端茸皮组织MEF2C基因的表达分析

为探讨肌细胞增强因子2(MEF2C)基因在梅花鹿茸生长发育过程中的生物学作用，以梅花鹿茸为试验材料，对其进行T-A克隆，以获得MEF2C基因的cDNA序列，再结合实时荧光定量PCR技术，对梅花鹿茸不同生长阶段(前、中、后期)顶端茸皮组织层MEF2C基因的表达量差异进行分析，结果表明：成功克隆出的梅花鹿MEF2C基因的完整编码区，全长为1 302 bp,共编码433个氨基酸，其中丝氨酸含量最高，占氨基酸总量的13.4%;蛋白质相对分子质量为46 898.44,理论等电点pI值为8.69,脂肪系数为65.77;分子式为C_(2011)H_(3210)N_(600)O_(654)S_(20),总原子数为6 495,不稳定系数为51.83,亲水性平均值为-0.662,MEF2C基因为不稳定的亲水蛋白；二级结构以无规则卷曲为主；亚细胞定位预测为细胞核内；通过Blastp功能对比显示，梅花鹿MEF2C基因与马鹿的同源性最高，为99.54%,与牛、羊的同源性也都超过99%。实时荧光定量结果分析表明，MEF2C基因在鹿茸生长不同阶段的顶端茸皮组织中都有表达，但表达水平不同，中期表达量是前期表达量的3.210 6±0.183 5倍，后期表达量是前期表达量的3.620 1±0.195 1倍，且前期与中期的表达量、前期与后期的表达量存在显著差异(P<0.05),而中期与后期的表达量差异不显著(P>0.05)。     

不同生长时期梅花鹿鹿茸差异蛋白质组学分析

旨在从分子水平认识鹿茸生长机制,本研究以10、40、60与130d的梅花鹿鹿茸为试验材料,运用双向凝胶电泳(2-DE)、质谱鉴定技术与生物信息学方法对梅花鹿鹿茸生长过程中差异表达蛋白质进行研究。结果显示,有46种蛋白质差异性表达,且主要参与细胞骨架、转运过程、信号转导、细胞凋亡、骨发育、蛋白质合成、核酸代谢、免疫、能量代谢、细胞增殖、抗氧化、蛋白质折叠等生物学过程。结合鹿茸的快速生长与快速骨化的独特生长过程,对差异表达蛋白质中的骨发育相关蛋白、抗氧化蛋白、细胞凋亡相关蛋白做进一步分析,发现P4HB、SPARC、过氧化物还原酶2、过氧化物还原酶4、半乳糖凝集素1、视黄酸结合蛋白1等6种蛋白质在鹿茸快速生长与快速骨化过程中起着重要的作用,为鹿茸生长与骨化机制的进一步研究奠定基础。     

不同生长时期梅花鹿鹿茸转录组分析

本研究旨在探究不同生长时期梅花鹿鹿茸的转录组差异,丰富梅花鹿鹿茸转录组信息。选取5个生长时期(10、20、28、44、66d)的梅花鹿鹿茸组织作为试验样品,利用Illumina HiSeqTM2500高通量测序,并用测序评估、基因注释等生物信息学方法进行分析。结果,经过测序、转录本拼接获得了375 657条contigs,平均长度为688bp,329 946个unigenes,平均长度为534bp。通过比对Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG、GO等7大数据库,90.07%unigenes得到了成功注释。其中39 674个(12.02%)基因成功注释到GO数据库,在level 2水平上共分为41个类别;17 732个(5.37%)基因成功注释到将KOG的26个类别中。对5个生长时期的鹿茸转录本文库进行比较分析,共发现了509个差异基因,其中407个差异表达基因成功注释到GO数据库中,主要为信号转导、氧化还原、转录调节、蛋白酶降解等生物学过程。其中转录调节基因PER1、EGR1的表达随着鹿茸的生长而增加,而GAS1则相反,随着鹿茸的生长而降低,推测PER1、EGR1、GAS1等转录因子在鹿茸生长过程中可能起着重要的调节作用。本研究利用高通量测序技术对不同生长时期的梅花鹿鹿茸组织进行了转录组测序和分析,筛选到了梅花鹿鹿茸在不同生长时期下的差异表达基因,并获得了差异表达基因的功能。     

双阳梅花鹿初角茸、二杠茸中氨基酸组成及含量分析

参照GB/T 5009.124—2003食品中氨基酸的测定方法,对双阳梅花鹿鹿茸中氨基酸组成和含量进行测定,采用主成分分析法分析了鹿茸中氨基酸主成分。结果表明:二杠茸中氨基酸含量高于初角茸中氨基酸含量。主成分分析表明,初角茸氨基酸第一主成分为Asp-Ser,第二主成分为Thr-Gly;二杠鹿茸氨基酸第一主成分为Cys,第二主成分为Tyr。     

南方梅花鹿年龄及鹿茸形态对产茸量的影响

运用SAS和SPSS11.5软件对127只梅花鹿500个产茸数据进行统计。分析年龄、鹿茸形态对南方梅花鹿产茸量的影响以及各年龄段产茸量之间的相关性。结果表明,年龄对梅花鹿鹿茸产量的影响很大,在一定范围内,鹿茸产量会随年龄(锯次)的递增而上升,峰值出现在第8锯,以后产量逐渐下降。不同年龄鹿茸产量之间也呈现极显著相关性,特别是第1锯对以后各年龄的产量影响十分显著。此外,三种形态的鹿茸与鹿茸产量间呈现极显著相关,表现为三杈茸二杠茸毛桃。     

鹿茸增产技术

鹿茸是养鹿生产的主要产品,每年脱换一次,头茬茸主要收获二杈茸(梅花鹿,每年6月下旬)和四杈茸(马鹿,每年5月底6月初),收获头茬茸后,于8月25日前可收获再生茸。如果头茬茸收获过晚或技术不得当,就不能生长再生茸。提高头茬茸的产量和质量对于养殖场是至关重要的,同时,提高再生茸的产量也可为鹿场增加一定的经济效益。影响鹿茸生长的因素很多,主要是营养、环境、管理等方面,其中营养是主要因素。     

IDO在梅花鹿茸角中的表达及对鹿茸软骨细胞分化的影响

以梅花鹿茸角为研究对象,通过原位杂交方法检测吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)和吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO2)在茸角中的表达。在培养的鹿茸软骨细胞中分别添加IDO1抑制剂1-甲基-L-色氨酸(1-L-MT)和IDO2抑制剂1-甲基-D-色氨酸(1-D-MT),作用24h后,通过荧光定量PCR方法检测软骨细胞分化标志分子Ⅹ型胶原(ColⅩ)表达的变化,进一步研究IDO1和IDO2对鹿茸软骨细胞分化的影响。结果显示:IDO1和IDO2主要在鹿茸真皮层成纤维细胞、间充质细胞和软骨细胞中表达。用浓度分别为200μmol/L和100μmol/L的1-L-MT和1-DMT处理鹿茸软骨细胞24h后,荧光定量PCR结果显示,ColⅩmRNA在鹿茸软骨细胞中的表达量均显著下降。结果表明:当IDO的活性受到抑制时,鹿茸软骨细胞的分化过程也受到明显抑制,IDO可能在梅花鹿鹿茸软骨细胞分化过程中起重要的作用。     

EM菌发酵秸秆饲料对梅花鹿增茸效果研究

试验在精料营养水平一致的前提下,研究饲喂不同方法发酵的EM菌对雄性梅花鹿产茸性能的影响。采用单因子试验设计,随机选择60只生茸期5岁成年公梅花鹿,随机均分为3组,分别为对照组、试验1组和试验2组,分别饲喂混合精饲料+不发酵秸秆粉、混合精饲料+发酵秸秆粉、混合精饲料+玉米面与秸秆的混合发酵饲料。记录鹿茸生长时间、测量茸重、茸尺,并进行鹿茸的等级评定和经济效益分析。结果表明:鲜茸重量试验组与对照组存在显著差异(P0.05),试验1组比对照组的平均茸量高60.90 g,差异显著(P0.05);试验2组比对照组的平均茸量高156.84 g,差异极显著(P0.01);试验2组比试验1组的平均茸重高95.94 g,差异显著(P0.05);在鲜茸品质方面,试验组优等茸比率有一定程度提高,但试验组和对照组差异不显著(P0.05);经济效益分析,由于试验组产茸量提高,试验1组、2组比对照组收入分别增加27.61%、40.99%。因此,本次试验表明,EM菌发酵秸秆饲料可以提高梅花鹿的适口性,对梅花鹿的增茸效果显著,可以在梅花鹿实际生产中应用。