羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。     

羊传染性脓疱病毒的分离鉴定

为了对羊传染性脓疱病毒的分离株ORF027基因、ORF059部分基因进行克隆、序列分析以及构建系统进化树,本研究应用犊牛睾丸细胞从病羊痂皮病料中分离获得了1株羊传染性脓疱病毒,命名为Orf-ys,在电镜下观察到了典型的病毒粒子。应用PCR方法扩增获得了2条基因片段,PCR产物克隆至pMD18-T载体,鉴定后测序。序列分析结果表明Orf-ys的2个基因分别与参考毒株的相关基因核苷酸同源性高达97.6%～98.6%和96.9%～98.4%。基因进化树比较显示,与美国OV-IA82株和意大利OV/C2、OV/mi-90株的进化关系最近。     

羊传染性脓疱皮炎病毒的细胞培养

在确定内蒙古白音锡勒牧场羊传染性脓疱皮炎的基础上,我们利用犊牛睾丸细胞培养白音锡勒牧场传染性脓疱皮炎病毒(Orf virus)获得成功,现将培养方法介绍如下。     

传染性支气管炎病毒S1蛋白基因的克隆与原核表达

根据GenBank中IBV基因序列,设计合成一对引物,成功地从IBV H52基因组中扩增了S1基因。经测序证实该序列全长1 685 bp,编码538个氨基酸。为便于表达,对其进行弃信号肽克隆,然后定向连接到表达载体中获得重组表达质粒pGEX-S1,转入受体菌,经诱导成功的表达了重组蛋白GST-S1。SDS-PAGE显示,该蛋白约为80 kD,占菌体总蛋白的8%,West-blot表明,其具有良好的免疫学活性。IBV S1基因的克隆和表达,为研究病原与细胞相互作用、开发基因工程疫苗奠定了基础。     

羊传染性脓疱病毒NZ2毒株CBP蛋白结构分析与表位预测

本研究应用生物信息学方法,以ORFV NZ2毒株的CBP蛋白氨基酸序列为研究对象,对CBP蛋白的理化特性、亲水性、跨膜区、信号肽、二级结构、三级结构、B细胞表位和T细胞表位进行了预测分析。结果显示,CBP蛋白的相对分子质量为31.179 89 kDa,理论等电点为4.68,半衰期为30 h,稳定系数为43.06,脂肪族指数为81.78,总平均亲水性为-0.383。CBP蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不属于跨膜蛋白,存在信号肽;二级结构中α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲分别占38.11%、33.91%、5.94%和10.48%,三级结构形似倒立的哑铃,上下对称。筛选出了6个优势B细胞表位、3个CTL细胞表位,无Th细胞表位。CBP蛋白为亲水性膜外蛋白,细胞表位较少,在细胞膜外为ORFV逃避宿主免疫反应发挥作用。本研究为CBP蛋白的功能研究与ORFV的致病机制研究提供了理论依据。     

羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株(OV/nm-05)GIF基因的克隆及序列分析

参考GenBank中羊传染性脓疱NZ2毒株GIF(GM-CSFinhibitory factor)基因序列,设计合成特异性引物,以羊传染性脓疱病毒内蒙古分离毒株(OV/nm-05)为模板,提取总DNA,用PCR技术特异扩增出该毒株GIF基因片段,将其克隆到pEASY-T1载体,鉴定后测序。应用计算机软件将OV/nm-05基因测序结果与参考毒株OV-NZ2、OV-D1701、OV-IA82、OV-SA00、OV-F07.808R、OV-MUK59/05、OV-F94.848R的GIF基因序列进行比较。结果表明,OV/nm-05与7株参考毒株的同源性分别为95.7%、98.2%、96.7%、95.5%、95.9%、95.5%、95.1%。     

羊传染性脓疱病毒湖北分离株CBP二级结构及其细胞表位的预测

参照GenBank中羊传染性脓疱病毒（Orf virus,ORFV）的毒力因子趋化因子结合蛋白（chemokine-binding protein,CBP）基因的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,以羊传染性脓疱病毒湖北分离毒株的DNA为模板,提取总DNA。采用PCR方法特异扩增该基因片段,得到CBP基因序列。通过网络平台的SOPMA服务器和DNAStar软件预测ORFV CBP蛋白的二级结构;综合利用DNAStar软件、二级结构预测及ABCpred方案预测羊ORFV CBP蛋白的B细胞表位;分别采用人工神经网络法（ANNA）和在线程序预测ORFV CBP蛋白的细胞毒性T细胞和辅助T细胞的抗原表位。结果显示,ORFV CBP蛋白的二级结构主要包括α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和β-片层4种类型,分别为α-螺旋占24.64%、β-片层占22.14%、β-转角占3.39%、无规则卷曲占49.29%;有7个优势B细胞表位,7个细胞毒性T细胞表位和3个辅助T细胞表位。本研究为ORFV诊断方法的建立、单克隆抗体的制备及表位疫苗的研制提供了理论依据。     

羊传染性脓疱皮炎病毒培养及免疫试验

羊传染性脓疱皮炎 (ORF)是羊的一种急性传染病 ,主要危害羔羊口腔 ,以口腔粘膜出现红肿、水泡、溃烂为其特征。该病传染性强 ,发病率高。自从Aynaud( 1 92 3)确定羊传染性脓疱皮炎是病毒性疾病以来 ,许多学者对该病进行了研究。在国外 ,2 0世纪 50年代Greig ( 1 957)、Webstes( 1 958)用羊胚胎皮肤细胞培养该病毒获得成功 ,随后在该病的防治等方面均有所突破。我国一些学者从2 0世纪 50年代开始对此病从病原学、流行病学、病毒培养、弱毒苗研制均作了大量工作 ,我所培育出免疫效果良好的弱毒疫苗。但是 ,近年来随着很多新品种的引进 ,全…     

羊传染性脓疱病毒的分离与鉴定

对采自松原市的疑似羊接触传染性脓疱性皮炎的羔羊病料,用犊牛睾丸原代细胞进行病毒分离培养,观察细胞病变;将出现病变的病毒细胞培养液接种家免和羔羊后,出现典型羊接触传染性脓疱性皮炎的临床症状;对病毒细胞培养液的电镜观察,发现了副痘病毒,证明确为羊传染性脓疤性病毒。     

羊口疮病毒陕西分离株B2L基因的克隆、序列分析及原核表达

为了对羊口疮病毒(ORFV)陕西分离株B2L基因进行克隆、序列分析及原核表达,根据GenBank已登录的ORFV(JN565694.1)B2L基因序列,设计合成一对特异性引物,应用PCR技术扩增ORFV B2L基因,并将目的基因连接到原核表达载体pET-28a中,成功构建重组质粒PET28a-B2L,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,成功克隆了ORFV陕西分离株B2L全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株B2L基因与国内外已报道的ORFV毒株核苷酸同源性超过97.3%,氨基酸同源性超过95.0%。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为42ku的重组蛋白,该蛋白能与羊口疮阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为ORFV的分子生物学特性研究提供资料,为进一步研制ORFV单克隆抗体及抗体检测ELISA试剂盒奠定了基础。     

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立及CBP基因的序列分析

根据GenBank中的羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列,设计合成1对引物,通过对PCR条件的优化,敏感性、特异性试验,成功建立了ORFV的PCR检测方法。敏感性与特异性结果显示,最低核酸检测量为1.2 fg/μL,对口蹄疫病毒、山羊痘病毒、丝状支原体山羊亚种的扩增结果均为阴性。同时根据GenBank中的ORFV的CBP基因的序列,设计合成1对特异性引物,以ORFV贵州分离株作为模板,成功克隆出ORFV的CBP基因。同源性分析表明,核苷酸与GenBank中ORFV的CBP基因的核苷酸序列相似性99.4%～88.8%。本研究为ORFV感染的流行病学调查和CBP基因功能研究奠定基础。     

抗羊口疮病毒蛋白ORFV086多克隆抗体的制备及其应用

本试验旨在克隆表达羊口疮病毒(ORFV)蛋白ORFV086,制备兔抗ORFV086蛋白多克隆抗体并检测ORFV086蛋白的表达。以ORFV基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增ORFV086的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-33b(+)。将构建的pET33b-086重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) pLys 感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,以纯化蛋白作为免疫原,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。应用ELISA和Western blotting方法对所得抗体进行检测。结果显示,重组蛋白pET33b-086主要以包涵体形式存在,分子质量约为100 ku;目的蛋白经切胶纯化回收后作为免疫原制备的多克隆抗体效价达1:128000;纯化的多克隆抗体可用于检测重组及天然ORFV086蛋白,特异性好。本试验制备了ORFV086多克隆抗体,为深入研究ORFV086蛋白在羊口疮病毒感染过程中的作用奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a( ),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

乙型脑炎病毒NS1蛋白的可溶性表达与抗原性分析

为获得可溶性表达的乙型脑炎病毒(JEV)NS1蛋白,将编码JEV SA14-14-2株NS1蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-c5X中,构建重组融合表达质粒pc5X-NS1;用重组质粒转化宿主菌ER2523后,经IPTG诱导得到可溶性的融合蛋白MBP-NS1;优化诱导表达条件,于28℃、0.3 mmol/L IPTG诱导4 h;最后融合蛋白经直链淀粉树脂柱纯化。结果表明:重组融合蛋白MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。     

贵州地区羊口疮病毒B2L基因克隆及原核表达载体构建

用H2L基因特异性引物对羊口疮临床疑似病料进行鉴定,采用PCR扩增出阳性样品羊口疮病毒结构蛋白B2L基因,回收纯化PCR产物,克隆至pMD18-T,测序结果表明插入的片段为目的基因,全长1137 bp。将目的基因定向克隆至pET-32a构建了B2L基因原核表达载体pET-32a-B2L,经PCR鉴定、酶切及进一步测序证明表达载体构建成功,为下一步的表达及基因工程疫苗的研究奠定了良好基础。     

Cloning and Sequence Analysis of Ankyrin Genes from Orf Virus GDZC Strain

To investigate the role of ankyrin proteins encoding by Orf virus (ORFV) in the immune modulation to host infection, five ankyrin (ANK) genes of ORFV GDZC strain were amplified using specific primers by PCR amplification and cloning from the viral genome DNA which extracted from virus infection cells,and their sequences and coding protein structure bioinformatics analysis were performed. The results showed that ORFV008, ORFV123, ORFV126, ORFV128 and ORFV129 consisted of 516, 525, 497, 501 and 516 amino acids, respectively, which shared a nucleotide identity of 98.3%, 98.7%, 97.9%, 97.3% and 98.0% with those of ORFV OV-SA00 strain, respectively. All of five ANK proteins contained ANK and F-box structural domain that showed they were structure conservative proteins. The analysis of protein transmembrane showed that ORFV123 and ORFV128 had no potential transmembrane domains, while the ORFV129, ORFV008 and ORFV126 had one, two and three potential transmembrane domains, respectively. And these ANK proteins had no signal peptide. These results provided the basic data for further study of the ANK proteins in the pathogenic and immune evasion mechanisms of ORFV.     

羊口疮病毒GDZC株锚蛋白基因的克隆及序列分析

为研究羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）编码的锚蛋白（ankyrin,ANK）基因在感染宿主中的免疫调节作用,本试验从ORFV GDZC株感染的细胞病毒液中提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增、克隆出5个ANKs基因,并进行了基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析。结果显示,获得的GDZC株ORFV008、ORFV123、ORFV126、ORFV128、ORFV129基因分别编码516、525、497、501和516个氨基酸,与OV-SA00毒株的核苷酸同源性最高,分别为98.3%、98.7%、97.9%、97.3%、98.0%。ORFV编码的5个ANKs都含有ANK结构域和F-box结构域,是结构保守蛋白。蛋白跨膜分析表明,ORFV123和ORFV128不含潜在跨膜区,ORFV129、ORFV008和ORFV126蛋白分别存在1、2和3个潜在跨膜区,且均不含信号肽。本研究结果为深入研究ANK在ORFV致病过程中作用和免疫逃逸机制提供了基础数据。     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物，以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板，扩增出一约1000bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET-32a中，并将重组质粒转化E．coli BL21（DE3），用1．0mmol／L IPTG在30℃下诱导表达。结果显示，F基因的表达量约占细菌总蛋白的35％。SDS-PAGE电泳显示，表达产物的分子质量约为55ku，与预计大小相符；经Western-blotting试验进一步证实，该基因获得了正确表达。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及其原核表达

为研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点,试验参照猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计、合成了1对引物,应用RT-PCR方法扩增出长为786 bp的基因片段,命名为zE2,将zE2基因克隆到原核表达质粒pET 32a中,经酶切鉴定后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达,大肠杆菌菌体裂解产物再经SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白的分子质量约为48 ku,主要以包涵体形式存在,且具有一定的免疫学活性。