成熟时间对水牛卵母细胞体外成熟的影响研究

研究体外成熟时间对沼泽型水牛卵母细胞核质成熟的影响。试验对比了24 h、25h、26 h2、7 h的成熟时间对卵母细胞第一极体排出率及体外受精后卵裂的影响。结果表明,在至少24 h之内大部分水牛卵母细胞就已经完成了完全的核质成熟。     

水牛卵母细胞体外成熟及体外受精过程中的皮质颗粒变化

用异硫氰荧光素联接的小扁豆凝集素(Fluorescein isothiocyanate-labelled Lens culinaris,FITC-LCA)标记不同体外成熟时间和不同体外受精时间的水牛卵母细胞的皮质颗粒,用激光共聚焦显微镜检测其分布情况.结果发现,皮质颗粒在水牛卵母细胞体外成熟培养前,70.1%卵母细胞的皮质颗粒呈现中间分布;培养24 h后,皮质颗粒皮层分布的卵母细胞达59.8%,分布形式由完全聚合向完全分散逐步转变.对不同体外成熟时间的卵母细胞进行体外受精时发现,体外成熟12 h的卵母细胞仅在受精后3 h有12.9%的皮质颗粒外排.随着成熟时间的增加,皮质颗粒的排放也趋于明显,成熟24 h的卵母细胞受精后3 h皮质颗粒外排率可达100%.结果表明,在水牛卵母细胞的成熟过程中,皮质颗粒的分布由中间分布逐渐向皮层分布转变,最后在卵母细胞的质膜下排列成单层;体外受精过程中卵母细胞皮质颗粒的排放速度取决于其在卵母细胞中的分布情况,故而与体外成熟时间呈正相关.     

不同成熟时间水牛卵母细胞成熟与凋亡的比较

为了解卵母细胞体外成熟与凋亡过程,进而提高卵母细胞体外成熟率,本试验研究了不同成熟时间水牛卵母细胞体外核、质成熟与凋亡的情况。结果表明:培养24 h,卵母细胞核、质成熟率分别达到61.4%和59.8%,与其他各时间组对比差异显著(P0.05),凋亡率也呈增加趋势,但差异不显著(P0.05)。     

磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究探讨了磷酸二酯酶(PDE)抑制剂Milrinone对水牛卵母细胞成熟的影响。水牛卵母细胞在含50μmol/L Milrinone的成熟液中培养16 h后,在不含Milrinone的成熟液中培养12 h、16 h和20 h,挑选形态正常的卵母细胞受精后培养,其分裂率(分别为59.1%,48.5%和50.6%)显著高于再培养8 h(29.5%)的卵母细胞(P0.05),但与其对照组(66.2%)相近,同时其卵母细胞受精后的囊胚发育率(分别为36.9%,33.6%和23.9%)亦显著高于8 h(15.5%)的卵母细胞(P0.05),但均与正常成熟培养的对照组(33.4%)相近。结果表明Milri-none对水牛卵母细胞的成熟具有明显的可逆抑制作用,经成熟抑制后的水牛卵母细胞恢复成熟后仍可保持较高的发育潜能。     

磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞减数分裂成熟的影响

本研究探讨了磷酸二酯酶抑制剂米力农(milrinone)对水牛卵母细胞体外自发成熟和促性腺激素诱导成熟的影响,以便提高卵母细胞体外成熟质量。试验对水牛卵丘卵母细胞复合体(COCs)培养不同时间或采取不同处理后,取出卵母细胞剥光后固定,然后用间苯二酚蓝染色,观察卵母细胞核成熟情况。结果表明:(1)Milrinone对水牛COCs的自发成熟具有抑制作用,且具有剂量依赖关系;(2)Milrinone对水牛卵母细胞体外自发成熟的抑制作用随培养时间的延长没有减弱,可作为水牛卵母细胞成熟过程中的核成熟抑制剂;(3)Milrinone能显著抑制促卵泡激素(FSH)诱导的水牛COCs体外成熟,但是随着时间的延长,这种抑制作用可以部分被FSH克服。     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活可帮助人们间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,且卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。本试验比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27h或30h的囊胚发育率（19.0%or 17.7%）明显高于体外成熟21h或24h的囊胚发育率（12.3%or 13.8%）;Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他激活方法;在相同条件下,孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚（13.0%vs.21.7%）。     

牛卵巢卵母细胞体外培养成熟条件的建立

研究不同犊牛血清浓度、培养时间和不同类型血清对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,添加体积分数为10%,15%和20%的FBS时,各组间卵母细胞成熟率差异不显著(p>0.05);培养时间为16h时卵母细胞成熟率与培养时间为20h和24h时的差异极显著(p<0.01),而培养时间为20h和24h时卵母细胞成熟率差异不显著(p>0.05);培养基添加OCS对卵母细胞成熟的影响效果与添加FBS的无显著差异(p>0.05),二者的卵母细胞的核成熟率均达到80%以上。     

水牛卵泡颗粒细胞对卵母细胞体外成熟的影响

为了系统研究颗粒细胞对水牛卵母细胞体外成熟的影响,使用颗粒细胞条件液处理或单层颗粒细胞和卵母细胞共培养的方法,探讨颗粒细胞共培养对水牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。结果显示,添加颗粒细胞传代接种第2天收集的20%颗粒细胞条件液到水牛卵母细胞成熟液中能显著提高水牛卵母细胞体外成熟率和囊胚发育率(P<0.05);然而单层颗粒细胞却显著抑制水牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育(P<0.05)。结果表明,与单层颗粒细胞共培养相比,与颗粒细胞条件液共培养更有利于水牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育。本研究为水牛卵母细胞体外成熟培养体系的完善提供一定理论依据。     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响,以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较.结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27 h或30 h的囊胚发育率(19.0%、17.7%)明显高于体外成熟21 h或24h的囊胚发育率(12.3%、13.8%);Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚.     

水牛卵母细胞成熟过程中激活蛋白激酶C对受精后原核形成的影响

为了研究成熟过程中激活蛋白激酶C(PKC)对水牛卵母细胞受精后原核形成的影响,试验采用水牛卵丘-卵母细胞复合体在不同成熟培养液(即添加PVA、FCS、PMA和PVA的基础成熟液或添加4α-PDD和PVA的基础成熟液)中成熟24 h后,将水牛卵母细胞随机分为5组进行体外受精。结果表明:20小时时检查原核的形成,PMA成熟培养处理的卵母细胞受精后的原核形成率为(66.7±2.3)%,与PVA和FCS阴性对照组[分别为(51.4±3.6)%、(46.8±5.1)%]相比差异不显著(P0.05),但激活PKC后受精形成原核的卵母细胞数比添加4α-PDD的对照组高且差异显著(P0.05)。说明在水牛卵母细胞成熟过程中激活PKC有利于提高两原核的形成率。