绵羊虱蝇形态学与分子生物学鉴定

绵羊虱蝇是绵羊体表常见的吸血寄生虫,对其形态学特征的研究较少。为提供能够快速、准确辨识此寄生虫的依据,本研究通过超景深三维显微系统和扫描电镜对绵羊虱蝇的形态特点进行了观察,并通过分析18SrRNA基因序列进行了分子学鉴定。结果显示,绵羊虱蝇翅完全退化,无平衡棒;头部短小阔扁,无单眼,复眼小,触角极短,刺吸式口器;胸部不分节,有3对足,足末端有发达的爪,4对气门;腹部不分节,雌虫腹部大而圆,末端凹陷;雄虫腹部小,末端凸出;周身布满刚毛。18SrRNA测序结果与GenBank中已公布序列相似度为99.59%。结果表明,本研究从甘肃酒泉绵羊体表采集的寄生虫为绵羊虱蝇,且此寄生虫有较易辨识的形态学特征。     

牛羽虱的形态学特征和分子鉴定

本研究旨在从形态学和分子水平对牛羽虱（Bovicola bovis,B. bovis）进行鉴定。对采自湖南省长沙市黄牛体表的虱子样品进行初步形态学观察后,通过PCR对虫体线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基（cytochrome c oxidase subunit 1,cox1）基因进行扩增,应用DNAMAN软件开展序列分析,并利用Mega 5.0软件最大似然法（maximum likelihood method）构建系统发育树。结果显示：3个虫体样本扩增片段长度与预期均一致,为389 bp,且其cox1序列与GenBank收录的牛羽虱（基因登录号MH001191）序列相似性为99.0%~99.5%;3个样本均与牛羽虱位于同一分支。本研究从形态学和分子水平证明采集样本为牛羽虱,进一步说明线粒体cox1基因可作为羽虱的分类鉴定遗传标记。     

猪囊尾蚴西昌分离株线粒体cox1和nad1基因的序列测定与种系发育分析

应用PCR技术对3个猪囊尾蚴西昌分离株的线粒体细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因全序列和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原酶第一亚基(nad1)基因部分序列进行扩增,分析其遗传变异,并用Mega 5.0程序NJ法绘制种系发育树,探讨不同地区来源的猪囊尾蚴种系发育关系。测序结果显示,猪囊尾蚴的cox1基因全序列长度为1 620bp,nad1基因部分序列长度为796bp。cox1和nad1基因序列均存在一定的遗传变异,且cox1基因序列的变异高于nad1序列。种系发育分析结果显示,所有猪囊尾蚴分离株构成一个分支,3个西昌分离株均属于猪带绦虫亚洲基因型。结果表明,cox1和nad1基因均可用于猪带绦虫的分子分类,为猪带绦虫病/猪囊尾蚴病的分子诊断奠定了基础。     

湖南省怀化地区白纹伊蚊核糖体18S rRNA和线粒体cox1基因的序列测定及分析

为探究湖南省怀化地区白纹伊蚊的基因变异、遗传多样性及其遗传进化关系,本试验以收集于怀化地区的30只白纹伊蚊为研究对象,利用PCR技术扩增其核糖体18S rRNA及细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cox1)基因序列,并对其基因变异、遗传多样性及遗传进化关系进行分析。结果显示,所获全部样品的18S rRNA和cox1基因序列长度均为489和1 004 bp;基于18S rRNA基因序列,怀化地区白纹伊蚊的种内差异为0～2.9%,种间差异为28.74%～61.46%;基于cox1基因序列,怀化地区白纹伊蚊的种内差异为0～0.2%,种间差异为6.08%～12.65%。基于18S rRNA、cox1基因序列所构建的进化树发现,来自于怀化市的白纹伊蚊全部位于同一分支上。结果表明,怀化地区白纹伊蚊之间存在一定程度的基因变异和遗传多样性,但它们之间的亲缘关系较近,且其18S rRNA、cox1基因序列的种内差异小、种间差异大,可作为白纹伊蚊鉴定的理想遗传标记。     

狐狸体表犬啮毛虱的形态特征观察和分子鉴定

本研究旨在利用全证据法对采自湖南省长沙生态动物园狐狸体表的2只寄生虱进行准确鉴定。首先通过显微镜观察寄生虱的形态特征，初步鉴定为毛虱。然后分别提取2只寄生虱的DNA样本，再以PCR扩增寄生虱线粒体细胞色素c氧化酶I亚基（cox1）基因的部分序列，进行序列分析，并利用Mega 11程序最大似然法（ML）构建系统发育树，从分子水平进一步对寄生虱进行鉴定。PCR扩增结果显示，两个样本条带大小与预期一致，均约400 bp；序列分析显示两个样本cox1序列与GenBank收录的犬啮毛虱（Trichodectes canis，基因登录号MH001214）相似性均为99.0%；系统发育分析显示，两个样本均与犬啮毛虱位于同一分支。结果表明，采自狐狸体表的寄生虱为犬啮毛虱。本研究为湖南省不同宿主犬啮毛虱流行病学调查提供了新的分子学证据。     

鲈鱼摩氏摩根菌的鉴定及药敏试验

从患病鲈鱼体内分离到1株优势菌LY2014,对其进行形态观察、生理生化试验、16SrDNA基因序列分析,同时采用Kriby-Bauer纸片扩散法进行耐药性分析。结果该菌为发酵型、具有动力的革兰阴性杆菌,根据生化试验结果初步确定该菌为摩氏摩根菌。以该菌的基因组为模板PCR扩增获得的16SrDNA序列长度为1 407bp(GenBank登入号为KJ830813)。该序列与GenBank数据库中摩氏摩根菌的16SrDNA基因序列相似性高达99%,系统进化树显示其与摩氏摩根菌亲缘关系最近,从而确定菌株LY2014为摩氏摩根菌。该菌株对磷霉素、菌必治和多黏霉素B高度敏感,对痢特灵、红霉素和诺氟沙星等5种药物中度敏感,对氨苄西林和氟苯尼考等11种药物耐药。     

猬迭宫绦虫线粒体cox3基因的克隆及序列分析

本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅲ亚基（cox3）基因部分序列（pcox3）的遗传变异情况。利用聚合酶链反应（PCR）扩增猬迭宫绦虫的pcox3,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,同时利用DNAStar 5.0中的Megalign程序进行同源性分析,再用Phylip 3.67程序MP法绘制系统发育树,并与GenBank中已知猬迭宫绦虫相应基因序列进行比对分析。结果显示,所获得的pcox3序列长度一致,均为264 bp,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分支,来自湖南省的猬迭宫绦虫pcox3序列有微小差异。本研究结果为猬迭宫绦虫进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础     

应用扫描电子显微镜对牦牛皮蝇三期幼虫的形态学观察

应用扫描电子显微镜对寄生于牦牛体的牛皮蝇、纹皮蝇和中华皮蝇(Hypoderma bovis,H.lineatum.H.sinense)三期幼虫进行了形态学观察。3种三期幼虫头部的形态结构差别不大。牛皮蝇三期幼虫气门板呈漏斗状,气门孔周围有粗壮的突棘,纹皮蝇三期幼虫气门板扁平,气门孔周围无棘;中华皮蝇三期幼虫气门板稍有凹陷,气门孔周围有少量小的突棘。牛皮蝇三期幼虫第十节的前缘和后缘上面无棘;纹皮蝇三期幼虫第十节的后缘上面有刺,前缘无棘;中华皮蝇三期幼虫第十节的前缘和后缘上面均有棘。     

猫源胎儿三毛滴虫的形态学观察及分子鉴定

旨在进一步鉴定从1例长期慢性腹泻猫粪便中新分离到的1株毛滴虫，分别对其进行了分离与体外培养、形态学观察及18S rRNA基因序列相似性分析。形态学观察结果显示，分离株毛滴虫呈梨形或纺锤形，且具有3根前鞭毛和1根后鞭毛，为胎儿三毛滴虫形态结构。18S rRNA基因序列与GenBank中三毛滴虫基因序列比对及系统进化树结果显示，分离的猫源毛滴虫序列与胎儿三毛滴虫MH400076.1处于同一分支，且相似性达到了99%。综合判定，从患有长期慢性腹泻猫的粪便中分离到的毛滴虫为胎儿三毛滴虫。     

山羊源枝睾阔盘吸虫的形态和分子鉴定

为鉴定采自西昌市6只山羊体内的小型吸虫的种类,本研究采用传统的形态学观察和PCR方法对其进行种类鉴定。经形态学观察,发现采自6只山羊体内的吸虫与枝睾阔盘吸虫形态相似;对6个样本虫株cox1基因部分序列进行PCR扩增和序列测定,并用cox1序列构建其与其他吸虫的系统发育关系。测序结果显示所获得的吸虫cox1基因片段大小为429 bp,6个虫株的同源性为97.7%~99.8%;构建的NJ系统发育树显示6个虫株与胰阔盘吸虫的亲缘关系最近。因此,结合形态学观察结果,将分离的6个小型吸虫虫株均鉴定为枝睾阔盘吸虫。研究结果为枝睾阔盘吸虫病的分子诊断、分子流行病学调查的进一步研究奠定了基础。     

云南蚕区新入侵桑树害虫双钩巢粉虱的初步鉴定

在云南蚕区受害桑树的叶片背部采集到一种新的粉虱类害虫,在实验室观察其成虫和卵的形态特征,并结合线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(mtDNA COⅠ)分子标记技术进行分类鉴定。观察采集粉虱样本的成虫及卵粒四周有粉状物和蜡丝包覆,雄成虫阳茎具有一个双钩结构;提取粉虱样本的基因组DNA,以mtDNA COⅠ基因的通用引物扩增、测序,将拼接序列提交NCBI数据库比对,与数据库中双钩巢粉虱同源序列(GenBank登录号:HM150635.1)的相似度为99%,截取657 bp片段序列比对,二者仅存在1个碱基差异。经过对该粉虱样本的形态识别与mtDNA COⅠ基因分子标记鉴别,初步鉴定其为入侵桑树的双钩巢粉虱(Paraleyrodes pseudonaranjae)。     

猕猴源毛滴虫的鉴定

本试验旨在通过形态学观察及基于18S rRNA和5.8S rRNA基因序列分析鉴别导致猕猴腹泻的肠道内毛滴虫,收集腹泻猕猴的新鲜粪便样本,经直接涂片、碘液染色后镜检观察寄生虫虫体形态;提取粪便总DNA,针对三毛滴虫18S rRNA和五毛滴虫5.8S rRNA基因序列设计特异性引物进行PCR扩增,对测序结果进行序列比对与进化树构建。形态观察结果显示,毛滴虫呈梨形或近似卵圆形,滋养体前鞭毛2～5条,后鞭毛1条;三毛滴虫18S rRNA和五毛滴虫5.8S rRNA序列PCR扩增仅获得18S rRNA基因序列,18S rRNA测序结果与GenBank中公布的来自犬的胎儿三毛滴虫序列的相似度高达97.2%。利用形态观察和分子生物学分析确认来自猴源的毛滴虫为猕猴源三毛滴虫。本试验结果对猕猴肠道寄生虫的鉴定与分析具有重要的临床诊断意义。     

爪哇花蜱的形态学和分子标记特征

为了便于识别和鉴定爪哇花蜱,本试验从湖南省长沙市南郊公园穿山甲体表采集了爪哇花蜱,并借助体视显微镜超景深系统观察雌、雄成蜱的形态结构,通过分子生物学技术测定了COX1和16S rDNA基因序列。结果显示,雌性成蜱假头基呈矩形;孔区小而深;须肢前宽后窄,第2节长;盾板暗赤褐色,无珐琅斑,心脏形;眼小而扁平,不明显,仅见一痕迹;肛沟位于肛门后;气门板呈逗点形。雄性成蜱假头基、须肢、眼、肛沟和气门板特征与雌蜱相一致;盾板特点为呈宽卵圆形,无珐琅斑,周缘暗赤褐色,中部稍浅,呈黄褐色。爪哇花蜱COX1基因序列与国外花蜱属蜱种Amblyomma fimbriatum、Amblyomma triguttatum等的COX1基因序列相似度均为83%;爪哇花蜱16S rDNA基因序列与嗜龟花蜱、龟形花蜱等花蜱的16S rDNA基因序列相似度为85%～88%,相似度均较低。结果表明:爪哇花蜱具有显著、易辨识、易鉴定的形态学和分子标记特征。     

犬体内类圆线虫的分子鉴定

为了鉴定来自斗牛犬体内的类圆线虫种类,试验提取了虫体的总DNA,对核糖体内转录间隔区(ITS)和线粒体细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)部分序列进行扩增、克隆、同源性分析及构建系统进化树。结果表明:rDNA ITS序列全长为580 bp,其中ITS1序列长度为216 bp;得到的cox1序列长度为961 bp;ITS1和cox1序列均与粪类圆线虫同源性最高,分别为99.5%和99.8%;基于ITS1和cox1序列与Gen Bank中相关线虫进行遗传进化分析,类圆属线虫处在一个大的进化分支上,亲缘关系最近。说明采自病犬体内的线虫为粪类圆线虫。     

几种拟地新线虫种间及种内线粒体lsrRNA及cox1基因的多态性

对来自世界各地的拟地新线虫共6个种的线粒体基因lsrRNA及cox1序列进行了PCR-SSCP和序列分析。结果显示，lsrRNA基因序列在拟地新线虫种内、种间的变异都比较小，不能提供准确的遗传标记。但cox1基因序列种间变异为0．5％～12.2%，比种内变异（1％～1．7％）大，能提供准确的遗传标记，可用于拟地新线虫姊妹种的鉴定。这些发现有助于拟地新线虫的生活史、传播途径、流行病学、种群遗传学的研究和其相关疾病的诊断。     

基于cox3基因分析蛇源裂头蚴种系发育关系

为分析野生蛇源裂头蚴与其它绦虫的种群遗传关系,本研究采集湖南省8个地区野生蛇肌肉中的裂头蚴,采用PCR方法对其线粒体cox3基因序列进行扩增、测序及分析。结果显示,湖南省8个裂头蚴分离株cox3基因核苷酸部分序列长度均为342 bp,其cox3基因核苷酸同源性为98.2%～100.0%,种内遗传差异性为0～1.8%,与其它科绦虫cox3基因核苷酸同源性为63.4%～73.9%,种间遗传差异较大,为26.1%～36.6%。cox3基因的系统进化分析结果显示,湖南省8个裂头蚴分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分支,与其它绦虫所属分支相隔较远。上述结果表明,蛇源裂头蚴线粒体cox3基因序列种内差异远低于种间差异,可以作为研究蛇源裂头蚴种系遗传变异的分子标记。本研究为蛇源裂头蚴的分子流行病学及其群体遗传研究奠定了基础。     

两种野生动物蛔虫线粒体cox1基因序列差异性研究

分离到湖南长沙生态动物园白狮和猎豹的两种野生动物蛔虫样本,对这两种蛔虫线粒体DNA(rDNA)中细胞色素I(cox1)序列进行扩增测序,并与Gen Bank中收录的猫弓首蛔虫、狸猫弓首蛔虫、犬弓首蛔虫、狮弓蛔虫和猪蛔虫cox1序列进行比较。结果显示:来自长沙生态动物园的白狮和猎豹蛔虫cox1序列长度均为415 bp;与Gen Bank收录JF780951. 1(狮弓蛔虫)序列用Blast软件比较,发现极少数的碱基置换、颠换、缺失及无差异。利用DNAStar 5. 0的MegAlign软件差异性分析显示,白狮蛔虫(WL1、WL2)基因序列和猎豹蛔虫(CH1、CH2)基因序列与JF780951. 1(狮弓蛔虫)序列的平均差异分别为4. 05%和2. 5%。而样品序列与其他序列相比差异均在10. 1%以上。因此,这2种动物4个蛔虫样品种内差异小,种间差异大,同是狮弓蛔虫。     

一例人感染带绦虫PCR鉴定

为了快速鉴别诊断一例人绦虫感染病例,采用聚合酶链式法(PCR)扩增线粒体cox1和Cytb基因片段,对PCR扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测和基因序列测序。分别与NCBI数据库中带绦虫cox1和Cytb基因序列进行比对,同时选用MEGA构建系统进化树。结果:核酸序列与NCBI数据库中牛带绦虫同源性均为99%,进化分析表明与牛带绦虫的亲缘性最近。表明该病例属于牛带绦虫感染。     

猪蛔虫线粒体cox3基因部分序列的比较分析

以采自广东4个不同地方的猪蛔虫为研究对象,PCR扩增其线粒体细胞色素c酶第3亚基(cox3)基因的部分序列并进行序列测定,测序之后与网上已发表的相关蛔虫的cox3序列进行比较分析。结果显示所有样品都扩增出了520 bp的cox3的部分序列,序列分析表明,不同地区的猪蛔虫样品cox3序列之间存在的种内差异在0.2%～2.8%,与网上发表犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫的相应序列差异明显,分别是16.8%～17.4%、18.0%～19.5%、18.2%～18.7%。研究结果为进一步研究猪蛔虫的分子遗传和种群遗传学奠定了基础。     

蓖麻蚕线粒体cox2基因的克隆、序列测定和分子系统学分析

利用兼并性引物克隆出蓖麻蚕线粒体cox2基因、tRNA Leu基因和cox1基因的部分片段。cox2基因编码框包含 6 85个核苷酸 ,编码 2 2 8个氨基酸的蛋白质 ;起始密码子为ATG ,终止密码子仅有 1个T组成 ;蓖麻蚕mtDNA的cox2基因中富含AT ,含量为 75 77% ,GC的含量为 2 4 2 3%。通过同源性比较 ,发现蓖麻蚕的cox2与柞蚕cox2同源性最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别是 89 0 %和 96 0 %。根据cox2氨基酸序列进行了 12种昆虫的分子系统学分析探讨。