首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 139 毫秒
1.
指数富集的配体进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是通过设计并合成一个含大量随机寡核苷酸文库,从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸,并结合体外PCR扩增技术,使其得到指数级富集,经多个循环分离得到亲和力和特异性最高的寡核苷酸结合序列.筛选出的寡核苷酸片段被称为适配体(Aptamer).适配体的概念最早是由Tuerk提出来的,适配子与其靶本子结合过程类似抗原抗体反应,凡是涉及抗体的领域几乎都可用适配体代替[1].近年来,随着SELEX相关技术的不断发展,适配体作为治疗药物已被广泛应用于生物医学的很多领域[2],如心血管疾病治疗、肿瘤的显像和治疗、靶向药物的输送和释放、艾滋病治疗等,本文就适配体治疗药物的特点、研究现状及其在传染病的防治领域的应用前景作一综述.  相似文献   

2.
氟苯尼考(FFC)具有胚胎毒性,在食用动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全。为建立快速检测动物性食品中FFC残留的方法奠定基础,本研究根据引物设计原则,设计了上下游引物,根据引物序列构建长度为80 bp的随机单链寡核苷酸(ssDNA)文库,其3'端和5'端为固定的20 bp引物结合位点,中间为40 bp的随机序列。通过氧化石墨烯-富集配体系统进化技术(GO-SELEX)筛选,即将经过预处理的ssDNA文库与等摩尔量的FFC及氧化石墨烯(GO)沉淀共孵育。通过GO的π-π共轭键吸附未结合靶标FFC的ssDNA,已结合靶标的ssDNA(FFC-ssDNA)则留在上清液中,通过离心获得FFC-ssDNA复合物。将每一轮筛选的FFC-ssDNA复合物经离心、抽提、醇沉淀回收所得到的ssDNA做为模板进行PCR扩增,通过链霉亲和素将PCR产物的双链DNA(dsDNA)彻底裂解为单链,作为次级ssDNA文库进入下一轮筛选。每一轮的筛选均计算一次回收率,当回收率变化趋于稳定时,引入反筛选物氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP),以去除与FFC特异性结合较差的ssDNA。当回收率达到饱和,筛选停止。最终,根据回收率的计算结果共进行了12轮核酸适配体的筛选,其中有10轮为正筛选,第7轮和第11轮为反筛选。PCR结果显示,经12轮筛选均得到了所需要的目的 ssDNA片段。对第9轮和第12轮的筛选产物克隆并测序,共得到46条不同的核酸适配体序列。经对46条核苷酸序列的二级结构、自由能(△G)预测和亲缘性分析,最终得到A1、A26、A27、A31、B18、B28、B30、B37共8条候选核酸适配体。通过测定8条候选适配体的解离常数(Kd值)分析其与FFC的亲和性。结果显示,8条候选适配体的Kd值在11.811 nmol/L~54.097 nmol/L;利用相同浓度的FFC、CAP、TAP对其中亲和性较高的A26和B18进行特异性试验,结果表明两条核酸适配体均可以与FFC特异性结合,且B18与FFC的特异性结合作用更强,可作为FFC的特异性核酸适配体。本研究首次对FFC的核酸适配体进行SELEX筛选,为建立快速检测动物性食品中FFC残留方法奠定基础。  相似文献   

3.
为筛选出兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60特异性核酸适配体,建立新型的兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)检测方法,本研究构建了一个长80 nt的随机寡核苷酸文库。以固定在PVDF膜上的VP60为靶分子,使用消减SELEX技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)进行20轮的筛选,以生物素标记的次级文库作为"一抗",以辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素作为"二抗",对文库进行Western blot鉴定,结果表明第20轮文库存在可特异性的识别VP60的核酸序列。随机选取第20轮文库的46条序列克隆、测序,得到20个高度同源序列,同时对46个适配体再次鉴定,最终得到3个特异性识别VP60的适配体。  相似文献   

4.
无浆体是一种专性血液寄生的可经硬蜱传播的病原体,世界范围内分布广泛。本研究旨在建立一种可以同时检测牛无浆体和山羊无浆体的双重PCR方法。通过对2种病原gltA基因和msp4基因位点引物的筛选,PCR反应体系中引物剂量、酶剂量和PCR反应条件中的退火温度、循环次数的优化,最终确定了一个引物组合和最适的PCR反应体系和条件,并对其进行了重复性和特异性验证。结果表明,本研究建立的双重PCR方法有效,操作简便、特异性、重复性良好,为兽医工作者和科研人员提供了一种山羊无浆体和牛无浆体感染快速鉴别诊断和流行病学监测工具。  相似文献   

5.
《中国兽医学报》2016,(6):1008-1014
核酸适配体作为一种优于单克隆抗体的新型识别分子,具有更高的分辨率,能识别配体间一个基团的细微差别,且所需的结合活性位点更小。本研究利用指数级富集配体进化技术(SELEX)筛选特异性结合于奶牛结合珠蛋白(HP)的DNA适配体,并对筛取的适配体进行特性分析。体外构建全长80bp中间含40bp随机序列的单链DNA(ssDNA)文库,通过对循环次数、退火温度及引物比例的优化,建立了适合的筛选体系;以超滤离心管为介质,HP蛋白为靶标,对随机ssDNA文库进行反复的SELEX筛选,从单链DNA文库中筛选能特异性结合HP蛋白的核酸适配体;利用DNAMAN和RNAstructure软件对获得核酸适配体进行一级结构和二级结构分析。结果表明,经过体外8轮筛选,随机ssDNA文库与HP蛋白的结合率由1.86%上升到31.35%,特异性核酸达到最大富集;经克隆和测序,获得了能与HP蛋白特异性结合的5个家族的DNA适配体,同源性均达70%以上,RNAstructure分析其二级结构主要以茎环结构为主,表明ssDNA形成不同的茎环结构可能是适配体与HP蛋白特异性作用的结构基础。初步建立HP蛋白核酸适配体库,筛选到与HP蛋白特异性结合的核酸适配体,为制备以HP为检测靶标的奶牛隐性乳腺炎检测试剂盒奠定基础。  相似文献   

6.
为筛选猫细小病毒(FPV)特异性核酸适配体,本研究利用体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从80 nt的单链DNA随机文库中筛选出与FPV高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。对FPV适配体共进行14轮筛选,采用dot blot鉴定,确定其中的Apt27和Apt52为候选适配体。MTT试验表明,Apt27和Apt52对CRFK细胞(猫肾细胞)无毒性作用。利用酶联寡核苷酸法(ELONA)测定Apt27和Apt52的解离常数,结果显示分别为18.3249±7.1723 nmol/L和24.7882±10.0067 nmol/L。同时采用dot blot、间接免疫荧光试验(IFA)方法检测Apt27和Apt52对不同病毒的结合情况,结果显示其对猫杯状病毒、猫疱疹病毒的结合力弱,而对FPV的结合能力较强。预测二者二级结构可见,Apt27和Apt52均具有环状、发卡状结构,其中茎环结构可能为适配体特异性识别FPV的基本结构。本研究首次筛选到特异性识别FPV的适配体序列,为FPV的检测与治疗制剂的开发提供了新思路。  相似文献   

7.
本研究旨在构建1种布鲁氏菌(Brucella)微滴式数字PCR方法(droplet digital PCR,ddPCR)。以布鲁氏菌BCSP31基因为靶基因,选取保守区域设计引物和探针,构建了布鲁氏菌微滴式数字PCR方法。然后优化了ddPCR反应中的引物、探针浓度及退火温度,并进行方法的灵敏度、特异性和重复性试验。结果表明,ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol·L-1和250 nmol·L-1,最佳的退火温度为58℃。ddPCR的线性良好,最低检测下限为1.12 copies·μL-1,与大肠杆菌O:157菌株等其他4种细菌无交叉反应,而且批内重复性和批间重复性都较好。综上表明,本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强,可对布鲁氏菌感染的临床样品进行定量检测。  相似文献   

8.
猪3种重要病毒寡核苷酸芯片诊断方法的建立   总被引:2,自引:0,他引:2  
将猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒-Ⅱ(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)分别应用生物信息学方法,针对病毒基因组保守序列设计特异性强的60-mer寡核苷酸探针,并将其按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片.分别设计出相应的引物,对待测样本进行不对称PCR扩增,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的单链DNA片段,并通过间接荧光标记技术使扩增产物标记上荧光染料.将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交.扫描、分析芯片上荧光信号.试验结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号.而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号.不对称PCR技术制备的单链DNA片段与寡核苷酸芯片进行杂交反应可同时、快速、特异性地检测多种猪疫病病毒.  相似文献   

9.
据猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)S基因序列设计1对特异性引物,通过对实时荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法,同时对12份病料进行检测,并与常规RT-PCR进行比较。结果显示,该方法的敏感性达到43.07拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性,而常规RT-PCR最低只检测到4.307×103 拷贝/μL,敏感性较低。本试验建立的检测TGEV S基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法为传染性胃肠炎的鉴别诊断及TGEV的分离鉴定奠定了技术基础。  相似文献   

10.
旨在利用抑制性削减杂交(SSH)技术筛选西农萨能奶山羊泌乳中期和后期的差异表达基因,并用实时定量PCR(Q-PCR)分析差异基因的表达丰度,探讨奶山羊不同泌乳阶段乳腺组织的基因表达规律。本研究以西农萨能奶山羊泌乳中期和后期乳腺组织的mRNA互为检测子(Tester)和驱动子(Driver)构建cDNA消减文库(M-L和L-M),随机挑选克隆测序,进行序列比对分析,并检测部分差异基因在乳腺组织中的表达丰度。结果,成功构建了泌乳中期和后期的cDNA文库,随机挑选30个克隆测序,得到M-L和L-M文库中与细胞凋亡、抗氧化、脂类代谢、能量代谢等生理过程相关的差异基因,对其中的6个基因进行实时定量分析,发现5个均为阳性克隆,表达水平增加了1.3~5.5倍不等。结果表明,利用SSH技术成功构建了泌乳中期和后期乳腺组织正反向消减cDNA文库,筛选出24个差异基因,为进一步研究奶山羊乳腺组织基因调控机理奠定了基础。  相似文献   

11.
非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用   总被引:4,自引:1,他引:3  
本研究为了建立一套检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列,设计引物和探针,优化退火温度、Mg2+浓度和引物、探针浓度,生成标准曲线,进行重复性、敏感性、特异性试验,并检测样品。结果显示,优化的退火温度为60 ℃,Mg2+终浓度为4 mmol/L,引物、探针终浓度分别为0.8、0.3 μmol/L。重复性试验变异系数均小于1.3%,敏感性试验最低能够检测到10拷贝/μL的质粒,以其他5种猪病病毒和ASFV质粒为模板进行特异性试验,只有ASFV质粒出现扩增曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏、特异的检测ASFV的方法。  相似文献   

12.
锦鲤疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立   总被引:4,自引:0,他引:4  
根据锦鲤疱疹病毒(KHV)胸苷激酶(TK)基因的保守序列设计一对引物和相应的TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,用于锦鲤疱疹病毒快速、灵敏、可定量的检测手段。构建并制备实时荧光定量PCR的标准品,对反应体系进行优化,并做特异性,敏感性和重复性试验。结果表明,成功构建荧光定量PCR标准品,建立荧光定量标准曲线,标准曲线的相关系数为0.992,所建立的荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,重复性好。  相似文献   

13.
依据牛、山羊、兔、猪等哺乳动物SRY基因高度同源性设计一对22 bp的SRY引物,按照3×2×3因子组合,建立了PCR扩增胚胎DNA最适条件。采用此最适条件扩增了15个羊-兔异种克隆胚胎DNA,结果表明PCR法可以用来鉴别哺乳动物胚胎的性别。采用设计的性别鉴定引物,按照最优PCR扩增胚胎DNA条件配制了PCR性别鉴定试剂盒。  相似文献   

14.
Species-specific PCR tests, based on the manganese-dependent superoxide dismutase A encoding gene (sodA) and the chaperonin 60 encoding gene (cpn60), were developed for the identification of Streptococcus phocae, a bacterial pathogen of seals. The selection of both oligonucleotide primer pairs was performed after amplification and sequencing of internal parts of both genes using universal oligonucleotide primers. The sequence studies of both genes additionally confirmed that S. phocae could taxonomically be classified to the pyogenic group of the genus Streptococcus.  相似文献   

15.
Direct detection of chicken anemia virus (CAV) DNA in tissues and sera was investigated by a polymerase chain reaction (PCR) assay. Using a pair of primers constructed to amplify the coding sequence of the CAV DNA genome, the PCR assay was shown to be extremely sensitive, being able to detect 1 fg of CAV replicative form DNA. The oligonucleotide primers used for the PCR yielded 583 base-pair (bp) amplified product, which was sized by ethidium bromide-agarose gel electrophoresis. Tissue samples from seven cases of suspected chicken infectious anemia were obtained for CAV isolation. DNA extracted from the homogenized suspension of pooled tissues of each case was analyzed by the PCR assay. Results showed that five of the seven cases were positive for CAV DNA by PCR, whereas CAV was isolated from four cases only. The PCR assay also detected CAV DNA in two of 37 serum samples from disease-free chickens. The specificity of PCR was confirmed by chemiluminescence dot-blot analysis of the amplified products.  相似文献   

16.
The genus Brucella causes significant economic losses due to infertility, abortion, stillbirth or weak calves, and neonatal mortality in livestock. Brucellosis is still a zoonosis of public health importance worldwide. The study was aimed to optimize and evaluate PCR assays used for the diagnosis of Brucella infections. For this aim, several primers and PCR protocols were performed and compared with Brucella cultures and biological material inoculated with Brucella. In PCR assays, genus- or species-specific oligonucleotide primers derived from 16S rRNA sequences (F4/R2, Ba148/928, IS711, BruP6-P7) and OMPs (JPF/JPR, 31ter/sd) of Brucella were used. All primers except for BruP6-P7 detected the DNA from reference Brucella strains and field isolates. In spiked blood, milk, and semen samples, F4-R2 primer-oriented PCR assays detected minimal numbers of Brucella. In spiked serum and fetal stomach content, Ba148/928 primer-oriented PCR assays detected minimal numbers of Brucella. Field samples collected from sheep and cattle were examined by bacteriological methods and optimized PCR assays. Overall, sensitivity of PCR assays was found superior to conventional bacteriological isolation. Brucella DNA was detected in 35.1, 1.1, 24.8, 5.0, and 8.0% of aborted fetus, blood, milk, semen, and serum samples by PCR assays, respectively. In conclusion, PCR assay in optimized conditions was found to be valuable in sensitive and specific detection of Brucella infections of animals.  相似文献   

17.
PCR法筛选大黄鱼微卫星DNA   总被引:2,自引:0,他引:2  
构建大黄鱼部分基因组DNA文库。以M13通用引物和根据微卫星核心序列所设计的引物,用PER法直接对文库进行扩增,获得15个PER阳性克隆,对阳性克隆测序。测序结果说明,6个阳性克隆中含有微卫星核心序列,用Primer3引物设计软件对侧翼序列进行微卫星引物设计。用6对引物扩增大黄鱼基因组,PER结果经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,其中2对引物能得到稳定的扩增。  相似文献   

18.
PRV、PPV双重PCR检测方法的建立及其应用   总被引:8,自引:0,他引:8  
为建立一种能够快速诊断猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的方法,根据GenBank上发表的PRV、PPV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增PRV、PPV的引物,经过条件优化后,建立检测PRV、PPV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为570bp、748bp。试验证明,该方法具有良好的特异性和敏感性,省时、省力、快速、敏感、高效的特点,为PRV与PPV的快速诊断试剂盒组装及流行病学的研究提供了技术支持。  相似文献   

19.
根据基因库中的口蹄疫病毒(FM—DV),猪水疱病病毒(SVDV)和水疱性口炎病毒(VSV)各基因序列,设计了与FMDV,SVDV和VSV互补的3对特异性引物,对样品中的cDNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为189bp,125bp和300bp。用这3对引物对病毒样品cDNA模板进行多次扩增,均能稳定得到与设计相符合的3条特异性条带。本试验能特异、敏感、快速地鉴定FMDV,SVDV和VSV。  相似文献   

20.
应用DPO-PCR方法特异性检测志贺氏菌   总被引:2,自引:0,他引:2  
In this study, a dual-priming oligonucleotide (DPO)-based PCR method for specific detection of Shigella was established using ipaH gene of Shigella as the target gene. The results showed that detection sensitivity of the DPO-PCR method was 1.65×102 CFU/mL. Compared with conventional PCR primers, the DPO primers were easily designed, which simplified the design procedure of PCR primers. DPO primers were not sensitive to annealing temperature, which could efficiently amplify the target gene in the annealing temperature range from 50 to 70 ℃. Moreover, due to the special structure of DPO primers, it had a higher specificity than conventional PCR primers, and none nonspecific amplifications were produced in reaction. In the practical application, tests on 133 samples including frozen/fresh meat, fruits and vegetables, fresh milk, eggs and cooked food by the DPO-PCR method showed that 15 samples were Shigella positive, which were in accordance with the testing results using GB method (GB/T 4789.5-2012), showing good practicality and reliability. The DPO-PCR method provided a new tool for fast and accurate detection of Shigella.  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号