不同家蚕品种对桑叶中1-脱氧野尻霉素的富集能力调查

家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(DNJ)来源于桑叶,为筛选对食下桑叶中DNJ有较强富集能力的家蚕品种用于功能性食品及药物的开发,以18个家蚕品种和6个桑树品种为材料,采用反相高效液相色谱-紫外检测法测定供试家蚕品种5龄第3天幼虫制备全蚕粉中的DNJ含量。不同地理系统家蚕品种对食下桑叶中DNJ的富集能力存在明显差异,其中日系品种与欧系品种对桑叶中DNJ的富集能力有显著差异(前者DNJ质量分数平均为0.3007%,后者为0.2469%),中系品种的DNJ质量分数平均为0.288 0%,与日系品种与欧系品种之间无显著差异;不同眠性(三眠与四眠)家蚕品种间对桑叶中DNJ的富集能力差异不明显。18个供试家蚕品种中,中系品种797对桑叶中DNJ的富集作用最强,其全蚕粉中的DNJ质量分数达0.4345%。选择6个家蚕品种分别取食不同桑树品种的桑叶,分析全蚕粉中的DNJ含量和桑叶中DNJ含量的相关性,其相关系数为0.826 0,全蚕粉中DNJ含量最高的家蚕品种与桑品种组合为家蚕乌2与陕桑403,其次为家蚕武功土种与甜桑、家蚕798与陕桑403。     

应用响应面试验设计优化酶法提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的工艺条件

桑叶中富含的1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)为一种哌啶类生物碱,是α-葡萄糖苷酶的强抑制剂,具有降低餐后血糖、抑制肿瘤转移和抗病毒等作用。应用纤维素酶法提取桑叶中的DNJ,在单因素试验考察纤维素酶的质量浓度、提取液p H值、提取温度、提取时间、料液质量浓度等5个因素对桑叶DNJ提取率影响的基础上,通过响应面法进一步优化得到的最佳提取工艺条件为:提取温度60℃,提取液p H值3.8,料液质量浓度0.017 0 g/m L,纤维素酶质量浓度3.4 mg/m L,提取时间1.0 h。用高效液相色谱测定在此优化工艺条件下桑叶DNJ的提取率为0.095 0%。与传统的水、酸提取桑叶DNJ的方法相比,采用该优化的酶法提取工艺条件桑叶DNJ的提取率显著提高(P0.01),比盐酸提取法提高了20.3%。     

59份野生桑桑叶中的DNJ含量及粗提物对α-糖苷酶的抑制活性

对来自云南省不同地区的59份野生桑桑叶中的1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量,以及桑叶粗提物对淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶的体外抑制活性进行了测定,同时采用液-质联用(LC-MS)仪分离纯化桑叶粗提物中的DNJ,并对其抑制蔗糖酶的机制进行了初步研究,期望筛选出适用于治疗糖尿病药物开发的药用桑资源,以及为解析桑叶粗提物和纯化的桑叶DNJ抑制α-糖苷酶活性的机制提供线索。研究结果表明:不同来源的野生桑桑叶中的DNJ含量存在明显差异,其中来自开远地区的岩桑桑叶中DNJ的质量分数高达0.791 1%,是具有药用开发价值的野生桑资源;不同来源的野生桑桑叶粗提物对淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活力的体外抑制率差异显著,但抑制活性的大小与样品中的DNJ含量不成正比,推测桑叶中除含有DNJ外还含有具有明显的α-糖苷酶抑制活性的多种DNJ类似物;从野生桑桑叶粗提物中分离纯化的DNJ对淀粉酶无明显抑制活性,但对蔗糖酶和麦芽糖酶有显著的抑制活性,对蔗糖酶表现为非竞争性抑制作用。     

加工工艺条件对桑叶茶中1-脱氧野尻霉素含量的影响

桑叶茶中的1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)是抑制α-葡萄糖苷酶活性的功能性成分之一,研究基本加工工艺条件以及杀青方法和处理时间、炒干时间等因素对制作桑叶绿茶中DNJ含量的影响,并应用高效液相色谱技术检测桑叶绿茶中的DNJ含量。采用微波加热、蒸汽加热和滚筒加热杀青,均可以使桑叶茶中的DNJ含量提高80%左右(P0.05)。其中,采用微波杀青(1 350 W)150 s,蒸汽杀青2 min,滚筒杀青(255℃)30 s,桑叶茶中的DNJ含量均可达到最高值。后续加工工艺中,揉捻和曲毫流程对桑叶茶中的DNJ含量无显著影响;在125℃加热炒干提香处理15 min后,桑叶茶中DNJ的含量达到最大值,但250℃加热炒干提香15 min,对桑叶茶中DNJ的破坏较大。试验结果表明:杀青方式及加工时间、加工温度等都会导致桑叶茶中DNJ的含量发生变化,应采用适宜的加工方式、加工温度及加工时间,以保证桑叶茶中DNJ含量的稳定性。     

桑叶1-脱氧野尻霉素(DNJ)对α-蔗糖酶的抑制动力学研究

从桑叶中提取的1-脱氧野尻霉素(DNJ)作为糖苷酶抑制剂具有降血糖的功能。为了解明桑叶DNJ对α-蔗糖酶的作用机制,应用酶抑制动力学分析桑叶DNJ(纯度95%)对α-蔗糖酶的抑制特性。通过建立的α-蔗糖酶酶促反应体系表明,在α-蔗糖酶质量浓度≤500μg/mL、反应时间8min以内时,反应体系呈现良好的线性趋势;抑制活性检测表明,桑叶DNJ对α-蔗糖酶具有明显的抑制作用,其半抑制浓度(IC50)为5.67mg/mL;依据酶抑制动力学曲线特征推断桑叶DNJ对α-蔗糖酶具有明显可逆的非竞争性抑制作用,其抑制常数Ki为6.73mg/mL。     

用反相高效液相色谱-紫外检测法测定桑叶中芦丁、槲皮素和1-脱氧野尻霉素的含量

为高效检测桑叶中的药用活性成分,进行了用反相高效液相色谱-紫外检测法(RP-HPLC-UV)综合测定桑叶中芦丁、槲皮素和1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量的试验。采用85%乙醇超声辅助萃取桑叶中的芦丁和槲皮素,以0.05 mol/L HCl为溶剂提取1-DNJ,并在pH8.5的硼酸盐缓冲液中进行衍生化反应,生成具有紫外吸收的1-DNJ-FMOC络合物。色谱柱为Alltima C18(4.6 mm×250 mm,5μm),检测波长分别为360、360、254 nm,流动相分别为V(四氢呋喃)∶V(0.02%磷酸)=25∶75、V(乙腈)∶V(pH4.0、0.5 mol/L醋酸缓冲液)=27∶73、V(乙腈)∶V(0.1%醋酸)=36∶64。检测结果显示:芦丁、槲皮素和1-DNJ的色谱图分离效果良好,峰面积与浓度呈高度正相关,回收率(n=3)分别为99.14%、98.89%、100.85%,相对标准偏差(RSD)分别为1.01%、0.33%、1.24%。试验显示建立在以上条件下的检测方法精密度高,检测结果准确可靠。     

高效液相色谱法测定桑枝黑木耳中 DNJ 的含量

通过柱前衍生化高效液相色谱法测定桑枝黑木耳中1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojimycin ,DNJ)的含量.结果表明 ,用芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)为衍生化试剂衍生化DNJ ,选择Waters X-bridge C18色谱柱 ,流动相为乙腈-0 .1% 醋酸(体积比55︰45) ,流速为1 .0 mL/min ,UV检测波长为254nm时 ,DNJ-FMOC 的峰面积与DNJ浓度呈高度正相关 ,相关系数为0 .9966 ,该检测方法灵敏、准确、稳定的、快捷 ,适合桑枝黑木耳等桑枝食用菌中 DNJ含量的检测.普通黑木耳不能自我合成DNJ ,但对桑枝中的DNJ有较好的富集能力 ,桑枝黑木耳中DNJ含量高达0 .3854% ,可利用桑枝黑木耳等桑枝食用菌对DNJ的富集能力来提高桑枝食用菌的开发利用价值.     

桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)的气相法测定

为了快速测定桑叶中的1-脱氧野尻霉素(DNJ)的含量,利用化学合成法将DNJ转化成沸点较低的酯类物质,并首次建立了用气相法快速检测DNJ的新方法,检测到桑叶中DNJ含量达到0.1294%。     

全蚕粉中1-脱氧野尻霉素的提取分离及分离物对肿瘤细胞的抑制作用

利用柱前衍生化反相高效液相色谱法检测不同前处理全蚕粉中1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)的提取分离效果,并研究其分离产物对人宫颈癌HeLa细胞的抗肿瘤作用。结果表明,超低温冷冻干燥、热风烘干和真空浓缩煎煮冷冻干燥所得全蚕粉中DNJ的质量分数分别为0.494 9%、0.383 9%和0.607 6%;冷冻干燥全蚕粉粉碎粒度为0.15、0.25和0.425 mm时,DNJ质量分数分别为0.494 9%、0.321 5%和0.089 5%;用稀酸浸渍及阳离子交换树脂提取与分离全蚕粉中的DNJ效果最佳,分离物中DNJ的质量分数达到1.08%。浓度为40 mg/mL的全蚕粉分离物对肿瘤细胞的生长抑制率达92.27%,可使肿瘤细胞增殖能力完全丧失。结果提示:采用真空浓缩煎煮结合超低温冷冻干燥、超细粉碎和稀酸浸渍及阳离子交换树脂分离技术,可有效提高全蚕粉中DNJ的提取、分离效率,含DNJ的全蚕粉分离物对HeLa肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用。     

HPLC-DAD法检测桑叶中的1-脱氧野尻霉素

本实验旨在建立检测桑叶中1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)方法。以0.05mol/LHCl为提取溶剂,芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)为衍生剂,在pH8.5的硼酸盐缓冲液中进行衍生化反应,生成具有紫外吸收的1-DNJ-FMOC络合物,采用C18色谱柱,乙腈和水为流动相,最大吸收波长为265nm处对目标物进行检测。结果表明:1-DNJ的色谱图分离效果良好,线性相关系数为0.9997,检出限为0.015mg/mL。样品平均加标回收率为81.3%~92.1%,相对标准偏差(RSDs)为4.7%~6.5%(n=5)。     

1-脱氧野尻霉素的来源及合成研究进展

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)是一种有效的α-糖苷酶抑制剂,具有显著的降血糖作用。野尻霉素最先从链霉菌中发现,而天然DNJ最先是从桑根皮中分离到的。在植物中,已从桑树(MorusL.)、鸭跖草(Commelina communis)、风信子(Hyacinthus orientalis)以及沙参属植物(Adenophora triphyllavar.japonica)中分离鉴定到DNJ,其中桑树中的DNJ含量最高,并且因桑品种、药用部位、季节气候、地理土壤、叶位和发育阶段等因素的不同而存在很大差异。在微生物中,已从多种链霉菌和芽孢杆菌中分离到DNJ,还发现从桑树中分离到的嗜麦芽寡养假单胞杆菌(Stenotrophomonas maltophilia)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus)2种内生菌也能够产生DNJ,已对多种微生物产DNJ的发酵条件进行研究。在昆虫中,除家蚕(Bombyxmori)富含DNJ外,野桑蚕(Bombyxmandarina)、桑蟥(Rondotia menciana)、桑尺蠖(Phthonandria atrineata)、桑螟(Diaphani apy-loalis)等取食桑叶的单食性或寡食性昆虫也富含DNJ,昆虫体内的DNJ来源于食物,其中家蚕体内DNJ的含量因蚕品种、发育时期、组织器官以及饲料等因素的不同而异,家蚕随龄期进展存在着对DNJ的吸收富集和排泄的周期性变化。目前已经对链霉菌、芽孢杆菌和鸭跖草体内DNJ的生物合成途径进行了探索,发现不同物种体内DNJ的合成机制不同。另已探明了DNJ的3种主要合成方法,人工合成的一些DNJ衍生物已经应用于临床。     

26种昆虫体内的1-脱氧野尻霉素含量测定

为发掘新的富含1-脱氧野尻霉素(DNJ)的昆虫资源,共测定了26种昆虫体内的DNJ含量。除家蚕(Bombyxmori)之外,野桑蚕(Bombyx mandarina)、桑蟥(Rondotia menciana)、桑尺蠖(Phthonandria atrineata)、桑螟(Diaphaniapyloalis)等4种仅取食桑叶的单食性或寡食性昆虫也富含DNJ,其中桑蟥和桑尺蠖幼虫中的DNJ质量分数分别为1.0648%±0.1134%、0.5138%±0.0083%,高于家蚕幼虫中的DNJ含量(0.4238%±0.0108%),并且桑尺蠖春季越冬代幼虫及其室内桑叶饲育的第1代幼虫和蛹、成虫均含有DNJ,具有开发利用价值。从桑园采集的兼性食桑昆虫中,人纹污灯蛾(Spilarectia subcarnea)、美国白蛾(Hlyphantria cunea)、大造桥虫(Ascotissele naria)、黄斑星天牛(Anoplophora nobilis)等4种昆虫的幼虫中含有微量DNJ,而褶翅尺蠖(Zamacra excauvata)、枣尺蠖(Sucra jujuba)、桑毛虫(Euproctis similis xanthocampa)幼虫和桑天牛(Apriona ger-mari)成虫中不含DNJ。豆天蛾幼虫(Clanis bilineata)等13种非食桑昆虫体内均不含DNJ。研究结果也提示取食桑叶的昆虫对DNJ的富集能力存在很大差异。     

微波干燥法加工的桑叶粉配制人工饲料的养蚕效果

本试验采用隧道式微波干燥设备干燥桑叶制作桑叶粉,以烘干法、晒干法、室内阴干法制作的桑叶粉为对照,分别配制人工饲料,采用一至二龄一次给饵法鉴定养蚕效果。结果表明,利用上述4种干燥方法加工的桑叶粉配制人工饲料养蚕,收蚁后24h疏毛率、存活率、龄期经过等指标差异不大,但起蚕率和蚕体重存在一定差异,168h三龄起蚕率以室内阴干法较高,二龄眠蚕体重以微波干燥法最重,两项指标均以80℃烘干法最差。综合考虑各种因素认为,微波干燥法是大规模生产优质桑叶粉比较理想的方法。     

桑树不同部位DNJ的含量分析

以SIGMA公司提供的DNJ样品为标样,用HPLC-PDA法对桑叶、桑枝皮层和桑枝木质部进行DNJ含量的分析测定。结果测得DNJ的含量分别是桑枝皮层为4.956mg/g;桑叶为1.622mg/g;桑枝木质部为0.409mg/g。     

不同全蚕粉中的1-脱氧野尻霉素含量及其对小鼠血糖浓度的影响

为探讨全蚕粉中1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojimycin,1-DNJ)含量与降血糖效果的关系以及蚕体内1-DNJ的来源,测定了7个家蚕品种或杂交组合以及用5个桑品种和不同叶质桑叶饲养5龄蚕制备的全蚕粉中1-DNJ含量,同时测定了由相应的全蚕粉配制的蚕粉复合物对小鼠食后1.5 h血糖值的影响。结果表明,不同家蚕品种以及用不同桑品种和不同叶质桑叶饲养家蚕制备的全蚕粉复合物的降血糖效果均存在显著差异,凡是降血糖效果显著的全蚕粉,1-DNJ含量都处于较高水平,而1-DNJ含量低的全蚕粉其降血糖效果均较差,但降血糖活性与1-DNJ含量之间并不存在显著正相关关系,说明全蚕粉中还存在其它降血糖活性成分。养蚕用桑中的1-DNJ含量与蚕体内1-DNJ含量存在高度正相关性,而且用不含桑叶粉的人工饲料饲养的家蚕幼虫不含1-DNJ,因此证实了蚕体内的1-DNJ来源于桑叶,家蚕本身不能产生1-DNJ。     

四川丘陵地区桑园合理施氮方案的研究

针对四川丘陵地区桑园偏施和过量施用氮肥的问题,设置0、120、240、360、480 kg/hm2尿素共5个施氮量试验组,通过比较与分析不同试验组桑叶产量和部分品质性状成绩,建立不同生产目的桑园施氮效应函数,提供合理的施氮方案。试验结果表明,少施或过量施氮都会降低桑叶产量及桑叶中营养活性物质的含量和桑叶营养活性物质的产量。240 kg/hm2的桑园施氮量能显著提高桑叶营养活性物质的含量;360 kg/hm2的桑园施氮量能显著提高桑叶产量及桑叶营养活性物质的产量。依据分别建立的桑园施氮量与桑叶产量、桑叶中的1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量、桑叶DNJ产量的肥料效应函数,推荐以生产养蚕用叶为目的的桑园最佳施氮量为360 kg/hm2,以提高桑叶DNJ含量和产量为目的的桑园最佳施氮量分别为299.56 kg/hm2和294.72 kg/hm2。