禽腺病毒感染SPF鸡的病变和病毒分布初步研究

鸡心包积液-肝炎综合征是一种急性传染病,由血清4型禽腺病毒引起。为了解该病原的主要致病特点,采用Ⅰ群4型禽腺病毒聊城分离株(SDLC 201601)接种SPF鸡胚,观察鸡胚病变;人工感染1日龄SPF鸡,对病死鸡进行剖检,观察主要病理变化,并采用PCR方法对各脏器进行病毒DNA的检测。结果发现,鸡胚试验组至接毒后第8天鸡胚全部死亡,接毒6 d后死亡胚出现心包积液、肝脏肿大、变性或出血及肾脏肿大、出血等典型病变。SPF鸡试验组在感染后第3天出现死亡并达到死亡高峰,第4天全部死亡,死亡率为100%,SPF鸡对照组无发病死亡;SPF鸡试验组死亡鸡主要病变在肝脏、心脏及肾脏等器官,其中肝脏的病变评分最高;死亡鸡的脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、气管、胰腺、小肠、法氏囊、肌胃、腺胃等脏器均检测到该病毒的DNA。表明该毒株对1日龄SPF鸡感染性强,可侵袭各组织脏器,为全身性感染,致死率可达100%。     

一例鸡传染性囊病的诊断及病毒分离鉴定

为获得目前引起传染性囊病的病毒对2017年5月山东青岛某蛋鸡养殖场疑似感染传染性囊病的病例进行了诊断和病毒分离。采用琼脂糖免疫扩散试验诊断该病;SPF鸡胚培养、动物接种分离培养病毒,用RT-PCR和琼扩试验鉴定鸡胚分离病毒。结果在琼脂糖免疫扩散试验中该病毒能与传染性囊病阳性血清呈现白色沉淀线;在SPF鸡胚接毒后第3~4天出现鸡胚死亡现象,且胚体皮下出血、绒毛尿囊膜增厚混浊等特征;RT-PCR反应中该抗原能利用特异性引物扩增出目的片段;对30日龄SPF鸡攻毒试验中出现腔上囊肿大,黏膜面有点状出血等病变。结果表明,在实验室确诊了传染性囊病并在鸡胚中成功增殖了该病毒。     

一例鸡新城疫病毒和大肠杆菌混合感染的诊断

解剖5只送检的临床发病鸡及病死鸡,发现4只剖检鸡均有腺胃乳头出血、直肠和泄殖腔出血,喉头有大量粘液等病变,2只鸡的气囊出现混浊.采集病料,处理后接种10日龄SPF鸡胚,发现鸡胚在48h左右死亡,收集死亡鸡胚的尿囊液,用1%的鸡红细胞进行血凝试验(HA),结果HA效价为27左右,进一步用新城疫阳性标准血清进行血凝抑制试验(HI),实验表明HI为阳性;对肝脏病料中进行细菌分离培养,结果 18h后麦康凯琼脂平板上,长出红色的菌落群,经生化鉴定为埃希氏大肠杆菌.由此可断定,该鸡群混合感染了新城疫病毒和大肠杆菌.     

一株鹅副粘病毒Ⅰ型野毒株的分离及其致病性测定

用SPF鸡胚从江苏省某一患病鹅群的肝、脾混合病料组织悬液中分离到一株病毒，该毒株能凝集(HA)鸡红细胞(RBC)，HA为2^6，并可被康复鹅血清、抗鸡新城疫(NDV)阳性血清、抗鸽NDV阳性血清所抑制，而不能被禽流感(H5、H9)标准阳性血清抑制。人工感染易感雏鹅，引起100％的发病和死亡，并有与自然病例相似的症状和病变；人工感染42日龄SPF鸡出现100％的发病和死亡。对该分离株作致病性测定，按照国际上规定的NDV毒力型判定标准，测定了该毒株最低致死量致死鸡胚的平均死亡时间(MDT)为39h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1．6，6周龄雏鸡静脉接种致病指数(ICPI)为2．67。试验结果表明，该分离株为强毒力型禽副粘病毒Ⅰ型(MPV-1)，命名为鹅副粘病毒Ⅰ型(GPMV-1)HC99株。     

鸡传染性支气管炎病毒山东分离株S1的测序分析及致病性

从山东某地疑似患肾型鸡传染性支气管炎(IB)的病死鸡的肝、肺、肾脏中分离到1株病毒,经过SPF鸡胚传代接种、血凝试验、鸡胚矮化试验、RT-PCR鉴定及测序分析、动物回归试验,确定为鸡传染性支气管炎病毒,并命名为SD/04/18株。结果显示,经3%胰蛋白酶处理后,病毒分离株有血凝性,未经处理病毒分离株不具有血凝性;鸡胚矮化试验发现该毒株明显抑制胚胎发育;进化树比对发现,该毒株与我国主要流行的QX株同源性最高,S1基因序列相似性为96.4%,氨基酸序列相似性为95.3%。分离株用SPF鸡胚连续传3代后接种8日龄SPF雏鸡,复制出了与自然病例相同的临床症状,肺、脾、肾、气管等器官出现典型病理变化。免疫组织化学法检测在气管环纤毛、肾小管上皮细胞间隙等部位可见抗原聚集。对被感染试验鸡的口腔、泄殖腔排毒进行跟踪检测,直到试验结束,被感染鸡仍有很高的病毒检出率。结果表明,最终确定该毒株为肾型鸡传染性支气管炎病毒。     

鸽新城疫病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从疑似鸽新城疫的信鸽饲养场分离到一株新城疫病毒。分离株利用电镜负染技术观察到典型的新城疫病毒粒子。生物学试验表明,该株病毒具有较强的毒力,最小致死量鸡胚平均致死时间（MDT）为68.4小时,1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）为1.375,6周龄雏鸡静脉接种致病指数（IVPI）为1.34,在鸡胚成纤维细胞上能引起细胞病变。动物回归试验证明,分离株能致2月龄鸽死亡。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒JH9801株的分离鉴定

从天津市某肉用鸡场疑似肾型传染性支气管炎（NIB）病鸡中取肾组织，按常规处理后接种9－10日龄鸡胚，连续传代培养至第7代，并对4－7代分离毒株的致病性、血凝性、EID50及对DNV的干扰性和乙醚敏感性进行测试，同时进行了动物回归试验。结果表明，4－7代分离毒株可使85％－90％鸡胚于接种后8－9d死亡，多数死胚和残存活胚胚体出血、蜷缩、矮化等具有IBV感染特征；该分离毒株无直接血凝性，但经10g/L胰酶处理后可集鸡红细胞；分离毒株对乙醚敏感；动物回归试验中有65％的感染鸡在15d内发病或死亡。剖检病死鸡可肾苍白、肿胀，肾小管内充塞大量尿酸盐，外观呈菜花样。经鉴定，分离的病毒株JH9801为鸡肾型传染性支气管炎病毒（NIBV）。     

鸡传染性支气管炎病毒LH2/01/10的分离鉴定

2001年在我国黑龙江省某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病鸡群中，分离到一株病毒，将该病毒接种10日龄SPF鸡胚，取72h的尿囊液进行电镜观察并用1％胰酶处理，结果发现尿囊液中存在典型的冠状病毒，用胰酶处理过的尿囊液能凝集SPF鸡的红细胞，初步鉴定为鸡的传染性支气管炎病毒。将该病毒尿囊液再次接种10日龄SPF’鸡胚，通过病毒对鸡胚的致病作用、病毒超微形态特征以及病毒凝集鸡红细胞的特性等对该毒株进行研究，结果表明：经胰酶处理后的病毒尿囊液可凝集鸡红细胞。鸡胚的第二代病毒尿囊液(命名为LH2,／01／10)分别接种1日龄和15日龄的SPF鸡，发现对不同日龄的鸡表现不同的致病性，对1日龄接种鸡和同笼饲养的同居对照鸡致病力高，发病率为11／11，致死率分别为4／6和2／5；15日龄接种和同居感染鸡发病率为9／9，致死率分别为1／5和1／4。实验应用反转录一聚合酶链式反应技术对LH2／01／10的膜蛋白基因进行扩增、克隆和序列测定，结果表明该基因具有IBVM基因的共有分子特征．与IBV标准株M41的M基因核苷酸的同源性为90％，氨基酸的同源性为91％。这从分子水平进一步证实引起鸡群死亡的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。     

鹅禽I型副粘病毒病的快速鉴别诊断

用禽流感免疫胶体金试验诊断一发病率高、死亡快、疑似禽流感或禽I型副粘病毒感染的鹅病例，结果为禽流感阴性；取病鹅肝、脾混合病料进行病毒分离，分离鸡胚尿囊液能凝集鸡红细胞（RBC），HA滴度为6log2，并可被康复鹅血清、抗鸡新城疫（NDV）阳性血清所抑制，而不能被禽流感（H5、H9）标准阳性血清抑制。分离病毒人工感染易感雏鹅，引起100％的发病和死亡，并有与自然病例相似的症状和病变；人工感染42日龄SPF鸡出现100％的发病和死亡。根据临床症状和病变情况、免疫胶体金试验以及病毒分离和鉴定，证明该鹅群患禽I型副粘病毒病。说明用禽流感免疫胶体金试验可以实现对禽流感、禽I型副粘病毒病的快速鉴别诊断。     

不同来源传染性支气管炎病毒诱导SPF鸡发病的免疫机制研究

试验旨在探讨不同来源的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)诱导SPF鸡发病的免疫机制。选用140只1日龄SPF白来航鸡,随机分为4组,3组攻毒组通过滴鼻点眼途径分别接种鸡源IBV强毒株、鸡源IBV弱毒株和野鸡源IBV毒株3个毒株,对照组以同种方式接种等量灭菌的磷酸盐缓冲液。在感染后12 h、36 h、72 h、7 d和14 d,每组随机选取5只进行剖检,并分别采集法氏囊、肾脏和气管组织,剩余鸡用于观察临床症状、发病及死亡情况。应用实时荧光定量PCR检测攻毒后不同时间点采集的各组织中IBV的病毒载量、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及部分细胞因子(白细胞介素(interleukin,IL)和干扰素(interferon,IFN))表达量的变化。结果显示,感染不同来源IBV毒株之后仅鸡源IBV强毒株感染组SPF鸡出现抑郁、翅膀下垂、甩头等典型的临床症状,且在感染后5~10 d共有7只死亡,死亡率为20%。病理剖检发现,感染鸡源IBV强毒株的鸡肾脏肿大、尿酸盐沉积和有花斑样病变,而感染野鸡源IBV毒株、鸡源IBV弱毒株和对照组的鸡无明显的眼观病变。实时荧光定量PCR结果显示,在鸡源IBV强毒株组的法氏囊、肾脏和气管3个组织中均检测到病毒。对照组和野鸡源IBV毒株组中均未检测到病毒,鸡源IBV弱毒株组只在部分组织中检测到病毒。在感染后72 h,鸡源IBV强毒株组与其他各组相比,TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15基因在法氏囊中的表达量均显著升高(P<0.05),IL-6和IFN-β参与更强烈的抗病毒免疫反应;在感染后7 d,鸡源IBV弱毒株组与其他各组相比,肾脏中TLR2、TLR3、TLR15、TLR21、IL-6和IL-18基因表达量均显著升高(P<0.05)。野鸡源IBV感染后36 h法氏囊组织中IFN-γ基因表达量显著上调(P<0.05)。综上所述,3个IBV毒株中仅鸡源IBV强毒感染引起SPF鸡典型临床发病症状与可视组织病变,且可提高SPF鸡组织中免疫相关因子的基因表达量。本研究结果揭示,不同来源的IBV对SPF鸡的不同致病性与其感染诱导的免疫反应不同有关。     

肉种鸡场鸡白痢和大肠杆菌病混合感染的试验研究

为研究及大肠杆菌和沙门氏菌对鸡的危害,无菌采集某鸡场送检的死亡肉仔鸡和鸡胚样品,进行病原菌的分离、鉴定,结果显示引起该鸡场鸡只发病的病原除大肠杆菌外,还伴有沙门氏菌的混合感染。其中11日龄自然死亡鸡样品、11日龄冻死鸡样品、18日龄冻死鸡样品、活鸡泄殖腔拭子样品大肠杆菌分离率分别为:66.7%、0%、36.4%和100%。沙门氏菌分离率分别为:88.9%、100%、63.6%和13.3%。其中11日龄自然死亡鸡样品混合感染率为55.6%。     

我国南方猪高热病的研究(Ⅱ)——猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的分离、鉴定和致病性测定

从我国南方某猪场高热病死猪的组织中分离出能引起Marc145细胞病变的病毒,经过血清中和试验、RT-PCR测定,确定分离物中存在美洲型猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)。将细胞病毒液感染13头55~105日龄健康猪,另有3头健康猪用于同居感染。随意挑取13头中7头再用大肠杆菌培养物加强感染,感染后每天测温,观察临床症状,记录死亡情况和病理变化。结果表明:PRRSV单独感染猪6/6发病,5/6死亡;大肠杆菌与PRRSV混合感染猪7/7发病,5/7死亡;同居感染的3头全部发病,1头死亡。所有感染猪于感染后2~4 d内均出现体温升高。两周后体温下降至正常,直到死亡前体温不再升高。死亡多集中在感染后的34~50d的2周时间内。将圈舍温度升至29℃对感染猪发病无加强作用。死亡猪的病理变化主要表现为严重的出血性、间质性肺炎,肢体远端皮表出血。结果表明,虽然PRRSV感染能够引起猪产生高热和高的发病死亡率,但从发病到死亡时间及某些病理变化上看,和南方猪场的发病死亡猪还存在一定的差异,这可能与猪场的一些激发因子或其他病原混合感染有关,从组织和细胞分离物的电子显微镜照片也证明了这一点。     

新城疫La Sota疫苗对山东分离株的免疫保护试验

用标准疫苗株La Sota活疫苗在隔离器中接种SPF鸡,进行免疫保护试验.免疫后,每7 d采血监测NDV抗体,免疫后2周,利用经过鉴定的新城疫病毒(NDV)潍坊毒SGM01、昌乐毒SCL03、东营毒HY、日照毒SRZ03、莘县毒SSX03和标准强度F48E9分别进行攻毒试验,同时设SPF鸡对照.每天观察,及时剖检发病鸡,检查鸡群病变,确定疫苗的保护性.结果表明,La Sota疫苗能对除SGM01和HY以外的病毒攻击的SPF鸡提供较好的保护.     

新城疫病毒在鸡胚不同组织增殖的研究

不同新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８、Ｎ－７９、ＬａＳｏｔａ和分离株Ｘ以１∶１００００稀释接种９日龄ＳＰＦ鸡胚,每胚０．２ｍｌ,结果发现,Ｆ４８Ｅ８和分离株Ｘ毒力较强,可在５０小时左右致死鸡胚,ＬａＳｏｔａ和Ｎ－７９较弱。Ｆ４８Ｅ８和Ｘ株接种鸡胚的肌肉、肝脏、脑和尿囊液均有大量病毒存在,而Ｎ－７９和ＬａＳｏｔａ只在尿囊液中有大量病毒存在,胚体病毒极少。     

火鸡冠状病毒的分离和初步鉴定

2003年国内某火鸡场发生了一种以侵害15～25日龄雏火鸡为主的急性传染病，主要表现为腹泻，十二指肠、直肠充血和出血，盲肠肿大，肠道内充满黄绿色内容物，死亡率约为10％～20％。取病死火鸡肝、脾、肠匀浆，取上清液通过尿囊腔接种15日龄SPF鸡胚。连续传代至第5代，收集接种后72h内死亡或存活鸡胚的卵黄和肠道，用于病毒分离和提纯。试验中发现该病毒能凝集兔红细胞，不能凝集鸡红细胞。经电镜观察，在病毒提纯液中发现有圆形或椭圆形、带花冠状纤突的病毒粒子，初步诊断为火鸡冠状病毒感染。进而设计针对火鸡冠状病毒S2基因引物，进行RT-PCR扩增，结果扩增出预期大小的片段。运用所分离病毒进行动物回归试验，感染火鸡出现与自然病例一致的临床症状和病理变化，并能从发病火鸡分离出该病毒。以上结果表明所分离的病毒为火鸡冠状病毒。此病毒的分离在国内尚属首例。     

鸡腺胃病变型传染性支气管炎病毒感染试验

本文采用腺胃病变型传染性支气管炎患病鸡的腺胃病料和H95株分离株尿囊液毒,对不同品种、不同日龄的易感鸡,采用不同的感染途径进行感染,对其增重、死亡等数据进行统计分析,结果表明:供试不同品种的鸡在不同的感染途径下,采用腺胃病料和鸡胚尿囊液毒分别感染,均可引起不同程度的感染发病,并出现和自然病例相同的症状和典型的病理变化。随日龄的增长,其易感率和死亡率呈下降趋势。从感染死亡鸡中可重新回收到相应的病毒,发病耐过的鸡可产生特异性抗体。     

SPF鸡人工感染禽源大肠杆菌、H9亚型禽流感病毒后的体液免疫应答和死亡率分析

SPF鸡经不同顺序、不同时间间隔人工感染MPAIV和E．coli 173株（04）后，对试验鸡的病死率和针对大肠杆菌不同抗原体液免疫应答水平等进行研究。结果表明：各混合感染组试验鸡病死率明显高于单独接种组，且以先接种MPAIV再接种E．coli组死亡率最高；各混合感染组试验鸡针对E．coli OMPs和LPS的抗体水平低于单独感染E．coli组，其中又以先接种MPAIV再接种E．coli组为最低，提示MPAIV和E．coli间存在协同致病作用，这种协同机理可能与因MPAIV的感染导致一定程度的免疫抑制并进而促进了E．coli在体内的定居与繁殖有关。     

新城疫LaSota活疫苗对基因Ⅶ型分离株的免疫保护性试验

从山东省发病鸡群分离鉴定了一株新城疫病毒(NDV),命名为SDLY01。经蚀斑纯化后进行毒力测定和序列分析表明分离株SDLY01属于基因Ⅶ型NDV强毒。20只7日龄SPF鸡免疫新城疫活疫苗LaSot a后14 d分别用NDV标准强毒F48E8和分离株SDLY01攻毒,同时设同日龄SPF鸡为对照组,未免疫任何疫苗。攻毒后观察10 d,免疫组在攻毒后食欲、精神均正常;对照组在攻毒后2～4d发病死亡,并表现ND典型的临床症状和病理变化。攻毒后第3、5、7、9 d对免疫组试验鸡取喉头、泄殖腔棉拭进行病毒分离,F48E8攻毒组病毒分离均为NDV阴性,SDLYO1攻毒组第5 d病毒分离NDV阳性,第3、7和9d病毒分离阴性。本研究结果表明LaSot a活疫苗对F48E8和SDLY01均能提供100%免疫保护,但不能完全抑制基因Ⅶ NDV分离株在体内的复制和排毒。     

肉鸡中嗜水气单胞菌分离与鉴定

从30例临床健康的6周龄肉食鸡泄殖腔内采集棉拭子，接种10日龄SPF鸡胚，发现鸡胚有死亡现象，并从4个样品致死的鸡胚中分离出了细菌。该种细菌的生化培养结果符合法国梅里埃公司细菌鉴定数据库检索系统圳20EV4．0和API 20NE EV6．0所述嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的特征。结果表明临床健康鸡可能携带嗜水气单胞菌。