猪肉中寄生虫与结缔组织的区别鉴定

根椐GenBank 中已发表的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)2 种病毒基因序列,分别设计2 对引物。在建立2 种病毒单项一步法RT-PCR 检测方法的基础上,优化一步法二重RT-PCR 反应条件,建立了2 种病毒的一步法二重RT-PCR 检测方法,用这2 对引物对同一样品中的美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV 核酸模板进行一步法二重RT-PCR 扩增,结果可同时扩增美洲型PRRSV 的265 bp 和欧洲型PRRSV 的451 bp 的特异性片段,而对其他4 种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该方法能检出10 pg 的美洲型PRRSV 和10 pg 的欧洲型PRRSV 模板。通过对175 份临床病料检测,将建立的一步法二重RT-PCR 技术和单项一步法RT-PCR 方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法二重RT-PCR 检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对美洲型和欧洲型PRRSV 的同时检测和鉴别诊断。     

美洲型和欧洲型PRRSV一步法二重RT-PCR快速检测方法的建立和应用

根椐GenBank中已发表的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)2种病毒基因序列,分别设计2对引物。在建立2种病毒单项一步法RT-PCR检测方法的基础上,优化一步法二重RT-PCR反应条件,建立了2种病毒的一步法二重RT-PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV核酸模板进行一步法二重RT-PCR扩增,结果可同时扩增美洲型PRRSV的265 bp和欧洲型PRRSV的451 bp的特异性片段,而对其他4种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该方法能检出10 Pg的美洲型PRRSV和10 pg的欧洲型PRRSV模板。通过对175份临床病料检测,将建立的一步法二重RT-PCR技术和单项一步法RT-PCR方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法二重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对美洲型和欧洲型PRRSV的同时检测和鉴别诊断。     

RT-PCR快速检测猪繁殖与呼吸综合征临床组织样品的研究

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列 ,在其核衣壳蛋白基因 (ORF7)保守区设计了一对跨幅约 380bp的特异性引物N1/N2 ,对已知PRRSVJK10 0 1毒株和PRRS临床病料进行RT PCR扩增 ,均扩增出约 380bp的特异片段。用此方法检测 5份疑似PRRS病例肺组织病料 ,结果均为阳性 ,对 2个阳性样品扩增产物进行克隆、测序 ,全长均为 372bp ,与PRRSVVR 2 332毒株ORF7同源性为 95%,证实为PRRSV的核衣壳蛋白基因。结果表明 ,建立的RT PCR检测PRRS临床组织病料特异、快速 ,可用于PRRS临床病料检测     

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。     

一步法多重RT-PCR检测猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸道综合征病毒

根据猪圆环病毒2型（PCV2）的ORF2和猪繁殖与呼吸道综合征病毒（PRRSV）ORF7相对保守区序列分别设计了两对引物PH1／PH2和PT1／PT2，将PCV2和PRRSV细胞毒按1：1混合，设为模拟样品，采用病毒基因组DNA／RNA提取试剂盒同时提取PCV2 DNA和PRRSVRNA核酸，利用2对引物进行一步法多重RT-PCR。结果同时得到与实验设计相符的560bp（PCV2）和398bp（PRRSV）特异性扩增条带，而对其他5种猪病原的扩增均为阴性。敏感性试验表明，建立的一步法多重RT-PCR方法可检测出10ngPCV2 DNA和5ngPRRSVRNA。     

PRRSV普通株与变异株鉴别诊断RT-PCR方法的建立与临床应用

通过对GenBank已公布猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）普通株与变异株Nsp2基因序列进行比对分析,设计合成3条引物,建立一步鉴别诊断普通株与变异株PRRSV的RT-PCR检测方法。结果表明,PCR扩增获得的普通株片段大小为267bp,变异株片段大小为180bp。敏感性试验结果表明该方法具有较高的敏感性,能检测到含量为1.5pg的核酸含量;特异性结果表明该方法在同等条件下检测PRV、CSFV、PCV-2、JEV、CPV、TGEV、SIV均为阴性。对2009-2010年送检的100份临床样品进行检测,结果检出26份变异PRRSV,8份普通PRRSV,阳性率为34%;与ELISA抗体检测试剂盒比较,多检出4份阳性样品。表明建立的鉴别诊断PRRSV的RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,适用于临床针对PRRSV的检测。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

根据欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计E1和E6 2套PCR引物和TaqMan荧光探针,建立E1和E6荧光RT-PCR方法,用于检测PRRSV。反应条件优化后,用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA进行PCR扩增以检测其灵敏度,同时对猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬(PRV)等7种病毒进行特异性检测。结果显示,建立的E1和E6荧光RT-PCR可以检出欧洲型PRRSV,敏感性依次为616和216个拷贝的PRRSV重组质粒DNA,而CSFV等非PRRSV均为阴性。建立的E1、E6荧光RT-PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可作为检测欧洲型PRRSV的技术储备。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪流感复合RT-PCR方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲型标准株（ATCC VR-2332）的部分ORF7保守序列、猪流感（SIV）A/Swine/HeNan/703/2001(H₃N₂)株的NP基因保守序列,设计合成了2对特异引物,分别扩增出大小为300和457 bp的特异性基因片段,通过优化RT PCR条件,最终建立了可同时检测PRRSV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,该方法能检出约10 pg总RNA病毒。应用该方法分别对河南省不同地区送检的26头份病死猪的鼻腔分泌物、气管、血液、肺组织等进行检测,结果9头份PRRSV阳性,4头份SIV阳性,其中4头份SIV和PRRSV同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性。结果表明,PRRSV和SIV复合RT-PCR诊断方法具有高度特异性和敏感性,为在分子水平上对PRRSV、SIV的混合感染进行早期快速诊断提供了科学依据。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Differential Detection of Classical,Highly Pathogenic and Vaccine Strains of North American Genotype PRRSV

To establish a rapid method for differential detection of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), a multiple RT-PCR assay was established. In this assay, two pairs of primers were designed according to the genomic sequences of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of PRRSV. The assay could only detect PRRSV, but not detect CSFV, FMDV, PRV and PCV2. The detection limit of the method was as little as 1.13×10³ copies/μL of templates. The established assay was successfully used to detect 349 clinical samples and 119 samples were positive for PRRSV, of which 5 samples were positive for classical PRRSV (C-PRRSV), 107 samples for highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) and 7 samples for TJM-F92 vaccine strain (V-PRRSV), while 7 samples were positive for HP-PRRSV and V-PRRSV. The results indicated that the established multiple RT-PCR assay could be used for differential detection and epidemiological investigation of PRRSV.     

口蹄疫病毒RT-PCR检测和分型方法的建立及初步应用

参考GenBank中各个血清型口蹄疫病毒3D、vp1、2A基因的标准序列，设计引物P1／P2和S1／S2。建立用于检测口蹄疫病毒及其利用引物S1／S2克隆片段同源性比较而确定血清型的RT-PCR方法。通过敏感性试验检测，2对引物均可以检测到10TCID50的病毒量；特异性试验的检测，2对引物对正常细胞、牛黏膜病病毒、猪瘟病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。利用该方法对病牛的流涎液体、水疱液体、舌皮组织、感染犊牛心脏等组织进行检测初步结果显示：该方法可以对O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒进行特异性检测，能够用于口蹄疫急性及亚临床感染的诊断及流行病学调查。     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因半定量 RT-PCR方法的建立及其在RNA干扰研究中的应用

为了建立以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法,根据PRRSV VR2332株病毒基因组和GAPDH序列设计4对特异性引物,分别扩增GP5、M、N和GAPDH基因序列,将shRNA表达质粒和GP5、M、N真核表达质粒共转染HEK293A细胞,应用该法检测了转染孔中GP5、M、N的相对表达量。同管和分管扩增法均建立了以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法。靶向GP5、M和N蛋白基因的shRNA表达质粒对其各自蛋白的抑制率为36%~69%,其中pSi-N3和pSi-G1抑制效果最为显著。结果表明,建立的半定量RT-PCR可以用于PRRSV主要结构蛋白基因表达水平的检测分析中。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GXA株分离及主要结构基因的克隆和序列分析

近来,广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊、仔猪呼吸道症状等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所致。本研究从病猪中采集材料,经RT-PCR检测为阳性后,接种于Marc-145细胞,经过6代盲传,发现典型的细胞病理变化(CPE),经鉴定为PRRSV,命名为GXA株,其毒价为105.33TCID50/mL。参考VR-2332和CH-1a株基因序列,设计了3对特异性引物,分别对GXA株的E、M、N基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。应用DNAstar生物学软件拼接得到GXA株的E、M和N3个基因片段共长为1473bp。同源性分析表明,GXA株与VR-2332、MLV和BJ-4的同源性为99.7%～100%,而与欧洲型代表株LV的同源性只有66.4%。表明GXA与VR-2332、MLV及BJ-4株亲缘关系比较密切,与欧洲型代表株LV亲缘关系最远,属于美洲型毒株,有可能来源于疫苗株。     

猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用简

为建立一种快速、敏感的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）检测方法,试验据GenBank中PEDV基因组序列,设计并合成针对M基因的内、外2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法。结果显示,单一使用外引物或内引物进行常规RT-PCR时检测限量均为50 pg PEDV RNA模板,而使用巢式RT-PCR可检测到50 fg PEDV RNA模板。使用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。结果表明,建立的巢式RT-PCR方法特异性、敏感性好,可快速准确地检测出样本中微量PEDV核酸。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。